本发明专利技术建立了一种利用微滴式数字化PCR检测外周血游离线粒体DNA含量的方法。所述方法包括重组质粒的构建、样本制备、提取血浆DNA和Exosome DNA、对血浆进行预处理，以及使用微滴式数字化PCR分析重组质粒mtDNA拷贝数等步骤。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用微滴式数字化PCR技术建立检测外周血游离线粒体DNA含量 的方法及其试剂盒，以及上述方法或上述的试剂盒在检测外周血游离线粒体DNA含量中的 应用。
技术介绍
在对外周血的分子诊断研究中，认为外周血循环的核酸成分可成为反映疾 病状态较好的指标。外周血循环DNA主要包含核DNA和线粒体DNA(mtDNA)。不同于 核DNA，mtDNA来自于细胞线粒体，为环状双链、多拷贝的DNA，且具有致炎作用。因此， 检测外周血游离mtDNA含量可能有助于监测疾病，如肿瘤、创伤、慢性炎症等。目前用 于检测外周血游离线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)含量的方法主要是利用实 时焚光定量 PCR(quantitativereal_time PCR，qPCR)的绝对定量法（Ajaz S, Czajka A,Malik A:Accurate measurement of circulating mitochondrial DNA content from human blood samples using real-time quantitative PCR. Methods in molecular biology (Clifton, NJ 2015, 1264:117-131. h该法首先通过普通PCR扩增线粒体基因组相 关基因，如ND1，C0X2基因等，将其克隆至质粒载体，构建含有线粒体基因的重组质粒。经过 浓度测定和计算后获得质粒的拷贝数，建立标准曲线，常用的浓度为10~10 sc〇pieS/iil。 在含量检测中，DNA样本与标准质粒同时进行qPCR反应，利用标准曲线计算样本mtDNA拷贝 数。然而，该方法在实验中发现在低拷贝数时准确度下降，并且可能会出现非特异性扩增， 从而影响实验的准确性。此外，目前的检测方法在对样本进行分析前均需提取DNA，然而目 前商品化的DNA提取试剂盒均存在提取过程DNA的丢失情况，且得率不一，可能造成结果评 判上的差异。因此，迫切需要一种准确性更高的检测方法用于外周血DNA分子的诊断研究。 微滴式数字化PCR (droplet digital PCR，ddPCR)是新一代的PCR技术，不同于传 统的qPCR技术，其原理是通过形成油包水微滴，将PCR反应分配至20000个微滴内（nl/微 滴），进行PCR反应后，逐一对每个微滴进行荧光信号的检测，含有荧光信号的微滴判读为 1，没有荧光信号的微滴判读为〇,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例，计算得出靶 分子的起始拷贝数。因此，ddPCR无需建立标准曲线，可直接确定低至单拷贝待检靶分子的 绝对数目。 因此，ddPCR在稀有突变的检测、基因拷贝数变异分析，以及基因表达分析等方面 的应用中已显示其优势。目前尚无关于利用ddPCR检测mtDNA拷贝数方法的研究报道。
技术实现思路
本专利技术涉及一种利用微滴式数字化PCR检测外周血游离线粒体DNA含量的方法， 主要包括以下步骤： 1)重组质粒的构建：通过PCR扩增MT-ND1基因，将MT-ND1PCR产物通过T-A克隆 至pMD?18-T载体，并转化大肠杆菌E. coli DH5 a . 2)样本制备：利用质粒小提试剂盒提取E. coli DH5 a的重组质粒，调整质粒拷贝 数，并稀释成1~l〇6copies/ y 1。 3)提取血浆DNA和Exosome DNA :采集外周血至EDTA-NaJjt凝管，分离血浆。 将500 y 1血浆分为两等分，其中250 y 1血浆采用磁珠法直接提取DNA，250 y 1首先分离 exosome，在exosome沉淀中加含有1U DNasel溶液中重悬并在37°C孵育lh以去除exosome 外的DNA。 4)对血衆进行预处理：取500 y 1血衆，1600g离心5min，上清转至新1. 5ml EP管； 16000g离心5min，取上清过0. 22 y m -次性过滤器；取预处理的血浆按1:1比例依次加入 1~104copies/ y 1 MT-NDl-pMD18-T标准质粒，混匀，混合样本直接作为模板进行DD-PCR 分析。 5)利用ddPCR分析重组质粒mtDNA拷贝数，包括设计引物和探针，利用重组质粒、 血浆DNA、血浆exosome DNA以及经处理或未处理的血浆作为模板，扩增体系形成微滴后在 PCR仪上进行扩增，扩增完毕后，将已完成PCR反应的96孔板置于BIO-RAD DX200Droplet Reader进行微滴读取，利用QuanatSoft 1. 6软件进行分析。 在一个实施方案中，所述方法步骤1中PCR扩增MT-ND1基因的引物序列如下：前 向引物为 5' CAGCCGCTATTAAAGGITCG3'，反向引物为 5' AGAGTGCGTCATATGITGTTC 3'，扩增片 段长度 1041bp〇 在一个实施方案中，所述方法步骤2中质粒拷贝数使用以下公式调整： MffDNA (dal tons) = (pMD18-T vector + Insert) X 660 (dal tons/bp)= (2692bp+1041bp) X 660 (daltons/bp) = 2. 46 X 106 (daltons)； CNDNA(copies / y 1) = CDNA (ng/ y 1) X 6. 02 X 1 014/MffDNA = C DNA(ng/ y 1) X 6. 02 X 1014/2. 46 X 106= C DNA(ng/ y 1) X 2. 45 X 108. (CNdna:质粒拷贝数；CDNA :质粒DNA浓度；MffDNA:质粒分子量） 在一个实施方案中，所述方法步骤5中所用引物和探针如 下：F : CCCTAAAACCCGCCACATCT ;R:GAGCGATGGTGAGAGCTAAGGT ;探针： CCATCACCCTCTACATCACCGCCC，使用 BHQ1 作为淬灭基团。 在一个实施方案中，所述方法步骤5的扩增体系中还包含空白对照和阴性对照， 其中空白对照为不含DNA模板的PCR体系，阴性对照为使用pMD-18-T质粒作为模板。 在一个实施方案中，所述方法步骤5生成微滴的步骤如下： 1)将20 y 1体系加入微滴生成卡上Sample孔中，70 y 1的微滴生成油加入Oil孔 中，该过程避免气泡产生和交叉污染，套上干净的专用胶条； 2)将微滴生成卡置于微滴生成器上，进行微滴生成过程，在该过程中，Sample孔 中体系与微滴生成油在负压的作用下，一并被混合至Droplet孔（微滴孔）以形成微滴； 3)取出微滴生成卡，吸取40 iil微滴至干净96孔板相应的孔内，盖上专用铝箱纸， 在180 °C按压封口后，普通PCR仪上进行扩增。 本专利技术利用ddPCR技术的检测原理，建立检测mtDNA拷贝数的方法并应用于外周 血游离mtDNA的分析。所述方法不仅具备优于qPCR的高灵敏度、特异性和重复性的特点， 且其对干扰物（如抗凝剂等）耐受能力高于qPCR。此外，本专利技术在建立检测方法的基础上， 进一步利用血浆样本直接作为ddPCR的模板，进行血浆mtDNA的分析，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用微滴式数字化PCR检测外周血游离线粒体DNA含量的方法，主要包括以下步骤：1)重组质粒的构建：通过PCR扩增MT‑ND1基因，将MT‑ND1PCR产物通过T‑A克隆至pMDTM18‑T载体，并转化大肠杆菌E.coli DH5α.2)样本制备：利用质粒小提试剂盒提取E.coli DH5α的重组质粒，调整质粒拷贝数，并稀释成1～106copies/μl。3)提取血浆DNA和Exosome DNA：采集外周血至EDTA‑Na2抗凝管，分离血浆。将500μl血浆分为两等分，其中250μl血浆采用磁珠法直接提取DNA，250μl首先分离exosome，在exosome沉淀中加含有1U DNaseI溶液中重悬并在37℃孵育1h以去除exosome外的DNA。4)对血浆进行预处理：取500μl血浆，1600g离心5min，上清转至新1.5ml EP管；16000g离心5min，取上清过0.22μm一次性过滤器；取预处理的血浆按1:1比例依次加入1～104copies/μl MT‑ND1‑pMD18‑T标准质粒，混匀，混合样本直接作为模板进行DD‑PCR分析。5)利用ddPCR分析重组质粒mtDNA拷贝数，包括设计引物和探针，利用重组质粒、血浆DNA、血浆exosome DNA以及经处理或未处理的血浆作为模板，扩增体系形成微滴后在PCR仪上进行扩增，扩增完毕后，将已完成PCR反应的96孔板置于BIO‑RAD DX200Droplet Reader进行微滴读取，利用QuanatSoft 1.6软件进行分析。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶薇，汤晓君，刘楚，杨政权，吕建新，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。