本发明专利技术涉及一种游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法，试剂盒包括第一试剂、第二试剂和磁分离试剂，其中：第一试剂为含有荧光素标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体、pH为7~9的缓冲液，荧光素标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体的浓度为0.5~1μg/mL；第二试剂为含有碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原、pH为7~9的缓冲液，碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原的浓度为0.02~0.1μg/mL；磁分离试剂为包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。本发明专利技术使得能够以更低成本和更高准确度和精密度对游离三碘甲状腺原氨酸进行定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种能够准确、灵敏、快速、定量检测人血清样本中游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)的化学发光免疫检测方法，该方法使用的试剂盒以及试剂盒的制备方法。
技术介绍
三碘甲状腺原氨酸(3，5，3’-三碘甲状腺原氨酸，T3)是一种分子量为651的碘化酪氨酸，与甲状腺素(T4) 一样是一种重要的甲状腺激素。它用于维持甲状腺功能，参加糖、脂类和蛋白质3大营养物质的代谢生理作用。三碘甲状腺原氨酸是甲状腺功能亢进的首选指标之一，并可作为判断疗效的可靠指标。99. 7%三碘甲状腺原氨酸在人体内都以与蛋白结合的形式存在，而真正发挥生理效应的游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)含量非常低。T3、T4在循环中均有结合态和游离态两种形式，正常情况下两种形式之间保持着动态平衡，其中游离态仅占极少部分但却发挥着真正的生理作用，很多情况下直接测定游离态的甲状腺激素来确定甲状腺功能。总T3、T4的水平会因为TBG的浓度变化而发生改变，但游离Τ3、游离Τ4的水平不会受到影响，因而甲状腺激素的生理功能不会受到影响。它是评价甲状腺功能和研究下丘脑一垂体一甲状腺轴的主要指标之一，可用于原发性及继发性甲状腺疾病的辅助诊断及疗效评价。FT3是目前医院开展的常规免疫检测项目，对甲状腺疾病的诊断有无可替代的重要参考价值。目前我国已批准上市的FT3免疫检测试剂有进口和国产两大类，其中进口试剂有雅培等跨国定量检测公司的产品，采用的方法学多为化学发光，而国产试剂中采用的方法学多数为放免法，近两年开始出现化学发光类产品。放免分析法存在线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。而化学发光免疫分析法具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用。然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。中国专利技术专利公开CN101949942A公开了一种了游离三碘甲状腺原氨酸检测试剂盒及其制备方法，其中，试剂盒包括包被有二碘甲状腺原氨酸-明胶的磁微粒混悬液、游离三碘甲状腺原氨酸系列校准品、辣根过氧化物酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗体、发光底物A液、发光底物B液及磷酸盐缓冲液。使用该专利公开的试剂盒成功利用了磁微粒免疫检测技术实现了对进行游离三碘甲状腺原氨酸的准确检测。然而，该试剂盒的制备成本和使用成本高，原因是，一方面，在进行包被有二碘甲状腺原氨酸-明胶的磁微粒混悬液的制备时，不仅过程复杂，而且直接将二碘甲状腺原氨酸-明胶包被于磁微粒上的包被率较低，导致较高的成本；另一方面，其采取辣根过氧化物酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗体，该抗体的制备也是非常繁琐，且标记率低，限制其检测效果和导致成本增加。此外，试剂盒在制备工艺上所存在的不易控和稳定性较差的因素，除了导致如前所述的成本增加的问题夕卜，还使得检测的批间差大，限制了检测方法的精密度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定方法，该方法不仅准确性好、灵敏度高，且精密度特别是分析间精密度高，此外该方法成本低。本专利技术同时还要提供一种游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定所用的试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现游离三碘甲状腺原氨酸准确和高精确地定量测定。此外，本专利技术还提供一种游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定所用的试剂盒的简便和低成本的制备方法。为解决以上技术问题，本专利技术采取的一种技术方案是一种用于游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)的纳米磁微粒化学发光测定的试剂盒，该试剂盒包括用于化学发光免疫检测的免疫反应步骤的免疫反应试剂，特别是，所述的免疫反应试剂包括第一试剂、第二试剂和磁分离试剂，其中 第一试剂为含有荧光素(FITC)标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体、pH为7、的缓冲液，所述荧光素标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体的浓度为O. 5! μ g/mL ；第二试剂为含有碱性磷酸酶(ALP)标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原、pH为扩10的缓冲液，所述碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原的浓度为O. 02、.1 μ g/mL ；磁分离试剂为包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。根据本专利技术，所述碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原可以采用常规的标记方法来进行连接。在本专利技术中，优选的标记方法是将二者用交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯来连接。申请人发现，采取辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)作为交联剂进行碱性磷酸酶和游离三碘甲状腺原氨酸抗原的偶联时，具有和其它交联剂相比更高的偶联效率，在降低制备成本的同时，有利于提高检测效果。因此，本专利技术的碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原优选由碱性磷酸酶与游离三碘甲状腺原氨酸抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。根据本专利技术，所述的第一试剂中的含有荧光素标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体是能够通过成熟和稳定的工艺容易地制备的。根据本专利技术，所述包被有抗荧光素抗体的磁微粒的制备也是较为容易的，且现有技术已有成熟的制备工艺可以参照。例如可以通过常规的物理吸附或化学偶联包被方式制备，没有特别限制。作为本专利技术的一种优选实施方案该包被有抗荧光素抗体的磁微粒中，抗荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。本领域技术人员应知晓，本专利技术的试剂盒还可以进一步包括有其它检测所需的试齐U，例如底物溶液。但是诸如底物溶液等其它试剂可以另行购买或配制，因此，虽然试剂盒中可以包括这些试剂，但它们对于本专利技术试剂盒来说并非必不可少。本专利技术采取的又一技术方案是一种上述的用于游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定的试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及所述磁分离试剂的步骤，其中所述第二试剂的制备过程如下①使游离三碘甲状腺原氨酸抗原与交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜溶剂中，在室温下反应，使生成三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物，于2 8°C下保存备用；②将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1.广1. 3混合，在室温下反应，使生成所述碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原，反应结束，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，选择适当的pH缓冲液调整浓度和pH值即得所述第二试剂。进一步地，所述的游离三碘甲状腺原氨酸抗原、所述碱性磷酸酶的纯度最好均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过lOOOu/mg，所述碱性磷酸酶的缓冲液的浓度优选为O. 5 1. 5mg/mL。 根据一个具体方面，第一试剂的制备方法如下配制含有荧光素的pH为扩10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定的试剂盒，所述试剂盒包括用于化学发光免疫检测的免疫反应步骤的免疫反应试剂，其特征在于：所述的免疫反应试剂包括第一试剂、第二试剂和磁分离试剂，其中：所述第一试剂为含有荧光素标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体、pH为7~9的缓冲液，所述荧光素标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体的浓度为0.5~1μg/mL；??所述第二试剂为含有碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原、pH为7~9的缓冲液，所述碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原的浓度为0.02~0.1μg/mL；所述磁分离试剂为包被有抗荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。
【技术特征摘要】
1.一种用于游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定的试剂盒，所述试剂盒包括用于化学发光免疫检测的免疫反应步骤的免疫反应试剂，其特征在于所述的免疫反应试剂包括第一试剂、第二试剂和磁分离试剂，其中 所述第一试剂为含有荧光素标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体、pH为7、的缓冲液，所述荧光素标记的抗游离三碘甲状腺原氨酸抗体的浓度为O. 5! μ g/mL ； 所述第二试剂为含有碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原、pH为7、的缓冲液，所述碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原的浓度为O. 02、.1 μ g/mL ； 所述磁分离试剂为包被有抗突光素抗体的磁微粒的悬浮液。2.根据权利要求1所述的用于游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定的试剂盒，其特征在于所述碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原由碱性磷酸酶与游离三碘甲状腺原氨酸抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。3.根据权利要求1所述的用于游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定的试剂盒，其特征在于所述包被有抗荧光素抗体的磁微粒中，抗荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。4.一种如权利要求广3中任一项权利要求所述的用于游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定的试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及所述磁分离试剂的步骤，其特征在于所述第二试剂的制备过程如下 ①使游离三碘甲状腺原氨酸抗原与交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜溶剂中，在室温下反应，使生成三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物，于21°C下保存备用； ②将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与三碘甲状腺原氨酸抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1.广1. 3混合，在室温下反应，使生成所述碱性磷酸酶标记的游离三碘甲状腺原氨酸抗原，反应结束，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，选择适当的PH缓冲液调整浓度和pH值即得所述第二试剂。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的游离三碘甲状腺原氨酸抗原、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过lOOO...
【专利技术属性】
技术研发人员：于大为，程晓蕾，李冬冬，
申请(专利权)人：苏州浩欧博生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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