一种甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法，该试剂盒包括含有荧光素标记的甲状腺素抗体的溶液、包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液，以及含有碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗原的溶液。本发明专利技术使得能够以更低成本和更高准确度和精密度对甲状腺素进行定量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种结合了免疫磁微粒分离技术和化学发光免疫分析技术的甲状腺素(T4)的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
甲状腺素即3，5，3’，5’一四碘甲状腺原氨酸(T4)，是一种分子量为777的甲状腺激素。T4在循环中有结合态和游离态两种形式，正常情况下两种形式之间保持着动态平衡。循环中T4有75%与甲状腺结合球蛋白(TBG)结合，15%与前白蛋白，10%与白蛋白结合。甲状腺激素的合成受许多因素的调节，最主要的是下丘脑、垂体、甲状腺轴。下丘脑分泌的促甲状腺素释放激素(TRH)可促进垂体分泌促甲状腺素(TSH)，TSH刺激甲状腺分泌甲状腺激素。相反，大量的甲状腺激素通过负反馈机制可减少TSH和TRH的分泌，使各种激素保持着动态平衡。甲状腺激素主要通过与核受体结合发挥生理作用，主要是调节能量代谢、增加产热作用和促进生长发育，具体包括①增强基础代谢；②加速蛋白质代谢；③加强脂肪代谢增加细胞氧代谢容量；⑤促进婴幼儿生长发育。测定血清T4含量是评价甲状腺生理功能的重要手段，一般情况下T4含量直接反映了甲状腺的功能状态，含量低表明甲状腺功能低下，含量高则是甲状腺功能亢进。因为绝大部分T4以结合态存在，而少部分的游离T4才是生理活性形式，且TBG为其最主要的结合蛋白，所以T4测定常受TBG水平的影响，另外，一些药物(例如苯巴比妥、痛可宁)也会影响体内的T4水平，因此临床应当注意结合患者具体情况解释检测结果。T4是目前医院开展的常规免疫检测项目，对甲状腺疾病的诊断有无可替代的重要参考价值。目前我国已批准上市的T4免疫检测试剂有进口和国产两大类，其中进口试剂有贝克曼等跨国定量检测公司的产品，采用的方法学多为化学发光法，而国产试剂中采用的方法学多数为放射免疫分析法，部分为酶联免疫分析法，近两年开始出现化学发光类产品。目前用于检测甲状腺素的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其具有上述诸多优点得到了广泛的应用。然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。中国专利技术专利公开CN102662068A公开了一种了甲状腺素磁微粒发光免疫分析试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括甲状腺素系列标准品，T4-1gG包被的磁微粒，碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗体，荧光发光底物，样本稀释液，浓缩洗涤液，还包括一个反应测试杯。该专利公开的试剂盒成功利用了磁微粒免疫检测技术实现了对甲状腺素的准确检测，对样本的能够实现高速、大通量的检测大批样本。然而，该试剂盒的制备成本和使用成本高，原因是，一方面，在进行T4-1gG包被的磁微粒的制备时，而且直接将磁微粒放置于T4-1gG的碳酸盐缓冲液中，制备时间较长，而且最终需要进行真空干燥，制备过程繁琐，对设备要求较高导致较高的成本。此外，试剂盒在制备工艺上所存在的不易控和稳定性较差的因素，除了导致如前所述的成本增加的问题外，还使得检测的批间差大，限制了检测方法的精密度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现甲状腺素准确和高精确地定量测定。本专利技术同时还提供一种甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，该方法工艺稳定，成本低，且所得试剂盒的精密度高。癌抗原所用的试剂盒的简便和低成本的制备方法。一种一种甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括第一试剂含荧光素标记的甲状腺素抗体的溶液； 第二试剂含碱性磷酸酶(ALP)标记的甲状腺素抗原的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。优选地，该碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗原由碱性磷酸酶与甲状腺素抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。进一步地，所述磁微粒试剂中，包被有荧光素抗体的磁微粒由荧光素抗体与磁微粒通过偶联剂相化学偶联。进一步地，所述第一试剂中的荧光素标记的甲状腺素抗体的浓度为0. 5^1 U g/mL,所述第一试剂的pH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗原的浓度为0. 02^0.1 u g/mL，所述第二试剂的pH为7-9。本领域技术人员应知晓，本专利技术的试剂盒还可以进一步包括有其它检测所需的试齐U，例如底物溶液。但是诸如底物溶液等其它试剂可以另行购买或配制，因此，虽然试剂盒中可以包括这些试剂，但它们对于本专利技术试剂盒来说并非必不可少。本专利技术米取的又一技术方案是一种上述的一种甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及磁分离剂的步骤，其中所述第二试剂的制备过程如下①使甲状腺素抗原与交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜溶剂中，在室温下反应，使生成甲状腺素抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物，于疒8°C下保存备用，其中所述的甲状腺素抗原、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg ；②将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与甲状腺素抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1. r1. 3的比例混合，在室温下反应，使生成所述碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗原，反应结束，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，选择具有适当PH值的缓冲液调整浓度和pH值即得，其中碱性磷酸酶的缓冲液的浓度为0.5 L 5mg/ml。优选地，步骤①中，取甲状腺素抗原，加入二甲基亚砜溶解该抗原至浓度为2(T50mg/mL，加入交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯，室温反应2 3小时，用二甲基亚砜将反应液1:10稀释，于21 °C下保存备用。优选地，步骤②中，取浓度大于等于5mg/ml的碱性磷酸酶的磷酸盐缓冲液，用PH 9^10的碳酸氢钠缓冲液稀释至0. 5^1. 5mg/ml，加入步骤①所得反应液，室温静置反应20 60mi nD 进一步地，所述的第一试剂的制备方法如下配制含有荧光素的pH为扩10的缓冲液，然后按照荧光素与甲状腺素抗体的分子比为2(T200:1的比例,将所述含有荧光素的pH为扩10的缓冲液与甲状腺素抗体的pH为扩10的缓冲液混合，混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，得到含有荧光素标记的甲状腺素抗体的溶液，接着用具有适当PH值的缓冲液调整浓度和pH，即得所述的第一试剂。其中适当PH值的缓冲液可以为例如含有0. 5%牛血清白蛋白、pH8. 0的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括：第一试剂：含荧光素标记的甲状腺素抗体的溶液；第二试剂：含碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗原的溶液；磁分离剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。

【技术特征摘要】
1.一种甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂含荧光素标记的甲状腺素抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗原的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。2.根据权利要求1所述的甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于 所述碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗原由碱性磷酸酶与甲状腺素抗原通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接构成。3.根据权利要求1或2所述的甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述第一试剂中的荧光素标记的甲状腺素抗体的浓度为O. 5 1μ g/mL，所述第一试剂的PH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗原的浓度为O. 02、.1 μ g/ mL，所述第二试剂的pH为7-9。4.一种如权利要求3所述的甲状腺素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法， 其包括分别制备所述含有荧光素标记的甲状腺抗体的溶液、所述含有碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗原的溶液以及所述包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的步骤，其特征在于所述含有碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗原的溶液的制备过程如下①使甲状腺素抗原与交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜溶剂中，在室温下反应，使生成甲状腺素抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物，于2 8°C下保存备用，其中 所述的甲状腺素抗原、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg ；②将含有碱性磷酸酶的缓冲液与步骤①所得溶液按照碱性磷酸酶与甲状腺素抗原与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的摩尔比为1:1.广1. 3的比例混合，在室温下反应，使生成所述碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗原，反应结束，将反应液通过G-25凝胶柱除盐， 选择具有适当PH值的缓冲液调整浓度和pH值即得，其中碱性磷酸酶的缓冲液的浓度为O.5 L 5mg/ml。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤①中，取甲状腺素抗原，加入二甲基亚砜溶解该抗原至浓度为2(T50mg/mL，加入交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯，室温反应 2 3小时，用二甲基亚砜将反应液1:1O稀释，于疒8 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：于大为，程晓蕾，
申请(专利权)人：苏州浩欧博生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：