吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒，吖啶标记结合物，包括依次连接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待标记蛋白；所述多聚氨基酸为含有羧基和氨基的多聚氨基酸；所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽。这种吖啶标记结合物的多聚氨基酸通过多聚氨基酸上的氨基与吖啶取代物反应形成化学键连接，待标记蛋白上的氨基与多聚氨基酸上的羧基反应形成‑NH‑CO‑结构从而将多聚氨基酸和待标记蛋白连接到一起，结合位点相对确定，避免了吖啶取代物对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，这种吖啶标记结合物的活性相对较高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外检测领域，尤其涉及一种吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒。
技术介绍
化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CLIA)，是用化学发光剂直接标记抗原、半抗原或抗体的免疫分析方法。用于标记的化学发光物质包括吖啶取代物，根据取代基的不同，吖啶取代物分为两类：吖啶酯(acridinium ester，AE)和吖啶磺酰胺，二者均为有效的发光标记物，通过起动发光试剂(NaOH、H2O2)作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。吖啶取代物作为化学发光标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂，检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低，与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。这类化合物从发光的机理来说特点是：1、发光反应中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来，即未发光部分与发光部分分离，因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。2、吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2的稀碱性溶液中即能发光。因此应用于化学发光检测具有许多优越性，优点主要有：①背景发光低，信噪比高；②发光反应干扰因素少；③光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑤标记物稳定(在2-8℃下可保存数月之久)。因此吖啶取代物是一类非常有效、非常好的化学发光标记物。吖啶标记结合物为吖啶取代物与待标记物(抗体、抗原，等)结合得到的复合物。吖啶标记结合物质量的好坏直接关系到化学发光免疫分析技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。目前常用的吖啶标记结合物的制备方法是碳二亚胺交联法，以碳二亚胺交联剂为桥，使吖啶取代物与待标记蛋白结合。然而，传统方法制得的吖啶标记结合物中，吖啶取代物与待标记蛋白通过碳二亚胺结合，吖啶取代物往往会对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，造成吖啶标记结合物的活性降低，影响免疫分析的灵敏度。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种活性相对较高的吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒。一种吖啶标记结合物，包括依次连接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待标记蛋白；所述多聚氨基酸为含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通过所述多聚氨基酸上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基与所述多聚氨基酸上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将所述多聚氨基酸和所述待标记蛋白连接到一起。在一个实施例中，所述吖啶取代物为吖啶酯、吖啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。在一个实施例中，所述多聚氨基酸为聚合度大于25的多聚赖氨酸。在一个实施例中，所述待标记蛋白为抗原、半抗原或抗体。一种上述的吖啶标记结合物的制备方法，包括如下步骤：用活化后的吖啶取代物和多聚氨基酸共价交联，充分反应后得到吖啶取代物-多聚氨基酸结合物，其中，所述多聚氨基酸为含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通过所述多聚氨基酸上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；对所述吖啶取代物-多聚氨基酸结合物进行纯化；用交联剂对纯化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸结合物上的羧基进行活化；以及用羧基活化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸结合物与待标记蛋白交联，充分反应后得到吖啶标记结合物，其中，所述吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待标记蛋白，所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基与所述多聚氨基酸上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将所述多聚氨基酸和所述待标记蛋白连接到一起。在一个实施例中，所述用活化后的吖啶取代物和多聚氨基酸共价交联的操作中，所述活化后的吖啶取代物和所述多聚氨基酸的摩尔比为1～10000：1。在一个实施例中，所述用羧基活化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸结合物与待标记蛋白交联的操作中，所述吖啶取代物-多聚氨基酸结合物与所述待标记蛋白的摩尔比为5：1～1：5。在一个实施例中，所述用交联剂对纯化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸结合物上的羧基进行活化的操作中，所述交联剂包括碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺。在一个实施例中，所述碳二亚胺选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N,N'-二异丙基碳二亚胺中的至少一种，所述碳二亚胺与所述吖啶取代物-多聚氨基酸结合物的摩尔比为5～1000：1；所述羟基琥珀酰亚胺选自N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺中的至少一种，所述碳二亚胺与所述羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为10：1～1：20。一种化学发光试剂盒，用于结合待标记蛋白形成如上述的吖啶标记结合物，所述化学发光试剂盒包括：吖啶取代物和多聚氨基酸；所述多聚氨基酸为含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸可以通过所述多聚氨基酸上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基可以与所述多聚氨基酸上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将所述多聚氨基酸和所述待标记蛋白连接到一起。这种吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待标记蛋白，多聚氨基酸通过多聚氨基酸上的氨基与吖啶取代物反应形成化学键连接，待标记蛋白上的氨基与多聚氨基酸上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将多聚氨基酸和待标记蛋白连接到一起，结合位点相对确定，避免了吖啶取代物对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，这种吖啶标记结合物的活性相对较高。此外，多聚氨基酸可使吖啶标记结合物的空间位阻增大，从而增加了吖啶标记结合物的使用灵敏度。附图说明图1为一实施方式的吖啶标记结合物的制备方法的流程图；图2为测试例2中得到的系列浓度TSH抗原样本检验结果散点图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。一种吖啶标记结合物，包括依次连接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待标记蛋白。多聚氨基酸为含有羧基和氨基的多聚氨基酸，多聚氨基酸通过多聚氨基酸上的氨基与吖啶取代物反应形成化学键连接。本实施方式中，多聚氨基酸可以为聚合度大于25的多聚赖氨酸。优选的，多聚氨基酸为聚合度为100～200的多聚赖氨酸。待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，待标记蛋白上的氨基与多聚氨基酸上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将多聚氨基酸和待标记蛋白连接到一起。待标记蛋白可以为本身就具有氨基的蛋白或多肽，也可以为通过修饰后引入氨基的改性蛋白或改性多肽。本实施方式中，待标记蛋白为抗原、半抗原或抗体。吖啶取代物可以为吖啶酯(DMAE-NHS、AE-NHS)、吖啶酸(9-吖啶甲酸)、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS)。根据吖啶取代物的具体不同，多聚氨基酸上的氨基与吖啶取代物上的不同基团(羧基、琥珀酰亚胺酯等)反应形成化学键连接。具体的，吖啶酯可以为AE-NHS(10-甲基-吖啶-9-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种吖啶标记结合物，其特征在于，包括依次连接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待标记蛋白；所述多聚氨基酸为含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通过所述多聚氨基酸上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基与所述多聚氨基酸上的羧基反应形成‑NH‑CO‑结构从而将所述多聚氨基酸和所述待标记蛋白连接到一起。

【技术特征摘要】
1.一种吖啶标记结合物，其特征在于，包括依次连接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待标记蛋白；所述多聚氨基酸为含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通过所述多聚氨基酸上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基与所述多聚氨基酸上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将所述多聚氨基酸和所述待标记蛋白连接到一起。2.根据权利要求1所述的吖啶标记结合物，其特征在于，所述吖啶取代物为吖啶酯、吖啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。3.根据权利要求1所述的吖啶标记结合物，其特征在于，所述多聚氨基酸为聚合度大于25的多聚赖氨酸。4.根据权利要求1或3所述的吖啶标记结合物，其特征在于，所述待标记蛋白为抗原、半抗原或抗体。5.一种权利要求1～4中任一项所述的吖啶标记结合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：用活化后的吖啶取代物和多聚氨基酸共价交联，充分反应后得到吖啶取代物-多聚氨基酸结合物，其中，所述多聚氨基酸为含有羧基和氨基的多聚氨基酸，所述多聚氨基酸通过所述多聚氨基酸上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；对所述吖啶取代物-多聚氨基酸结合物进行纯化；用交联剂对纯化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸结合物上的羧基进行活化；以及用羧基活化后的所述吖啶取代物-多聚氨基酸结合物与待标记蛋白交联，充分反应后得到吖啶标记结合物，其中，所述吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、多聚氨基酸和待标记蛋白，所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基与所述多聚氨基酸上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将所述多聚氨基酸和所述待标记蛋白连接到一...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱纯亘，肖成勇，祝亮，刘陶旭，夏福臻，
申请(专利权)人：深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44