基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒，涉及一种染色体非整倍体的定量检测试剂盒。提供一种快速、灵敏、特异，用于临床染色体非整倍体疾病检测的基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒。设有盒体、杂交连接试剂、扩增试剂和参照试剂；所述杂交连接试剂、扩增试剂和参照试剂设在盒体内；所述杂交连接试剂包括LDR混合液、CA连接缓冲液和CA连接酶；所述扩增试剂包括CA?PCR混合液A、CA?PCR混合液B和CA酶混合液；所述参照试剂包括CA正常对照和CA阴性对照。该体系由杂交连接和实时PCR两部分组成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种染色体非整倍体的定量检测试剂盒，尤其是涉及一种基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒。
技术介绍
染色体(chromosome)是遗传物质的载体，真核细胞的基因(gene)大部分存在于染色体上，并随着染色体的传递而传递。染色体的数目与形态结构具有物种特异性，即在同一物种中，染色体的数目与形态结构是恒定的，如此得以维持该物种的特征。染色体如果发生了异常，将会导致许多基因的剂量变化如增加或减少，进而导致出现多种畸形的综合征， 称之为染色体综合征。染色体异常包括结构异常和数目异常，数目异常又分为整倍体改变和非整倍体改变。染色体结构变异所造成的表型改变往往较轻且不固定。整倍体改变往往是高度致死的， 患病胎儿无法存活至出生。而非整体在新生儿中出现的比例高，造成的病征严重，且目前尚没有有效的治疗手段。一个体细胞的染色体数目增加或减少了一条或数条，称之为染色体非整倍体 (chromosomal aneuploidy)，这是临床上最常见的人类染色体畸变类型。迄今为止，在人类 22条常染色体中只发现21三体，18三体和13三体这三种类型的非整倍体活产儿，而其他常染色体非整倍体胎儿均在妊娠早期自发性流产。对于非整倍体胎儿目前最为有效的控制方法只能是通过产前诊断确诊后采取中止妊娠的方法预防患病胎儿的出生。因此染色体非整倍体的产前诊断一直是医学遗传学的研究热点。目前，染色体非整倍体的产前诊断以细胞生物学方法为主要手段，分子细胞生物学与分子生物学方法互为有效补充。细胞生物学方法主要指染色体组型分析(karyotyping)，也称核型分析。目的是对待测细胞的全部染色体按大小、形态特征等排列后形成的核型(karyotype)进行数目与形态的分析，以确定是否与正常核型完全一致。染色体组型分析不仅可以诊断整条染色体的丢失和增加，还可以检测缺失、重复、易位、重组等染色体结构异常，并且具有直观的形态结果和很高的可信度，因此三十多年来，此项技术没有太大的改变却仍然是国内外染色体异常的产前诊断金标准，并有许多相应的试剂盒面世。虽然如此，这项技术却有明显的不足之处。首先，从样品采集至结果输出，整个诊断过程需要大约两周时间，容易给受检对象造成较大的心理负担；其次，虽然有商品化的试剂盒与相关软件的帮助，这项技术仍需要较为专业的从业人员进行细胞培养、结果判断等工作；第三，存在细胞培养失败、母源细胞污染等较多不确定因素。这些不足之处决定了染色体组型分析是一个耗时、高成本、低通量的诊断技术。上世纪末，分子生物学技术与传统细胞生物学技术结合形成了许多分子细胞遗传学技术。这些分子细胞遗传学技术与分子生物学技术作为传统染色体组型分析的有效补充，主要具有快速、低成本、高通量等特点。但是由于许多方法面世的时间并不长，因此仍然需要更大量的临床评价和进一步的完善。荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization, FISH)(Nederlof PM, van der Flier S, Wiegant J, et al. Cytometry, 1990,11 :126-31)和比较基因组杂交技术(Comparative genome hybridization, CGH) (Barrett IJ, Lomax BL, Loukianova T，et al. Arch Pathol Lab Med,2001,125 :81-4) 1 是分子细胞生物学技术的典型。它们的原理都是利用荧光标记的DNA探针与处于中期或间期的羊水细胞内染色体DNA杂交，然后通过荧光显微镜等仪器观察荧光的分布和数量来判断染色体异常的情况。这两项分子细胞生物学技术由于其灵敏度高、特异性强等优点被广泛应用于确定未知区域的染色体重复和缺失、染色体不平衡片段的识别以及染色体重排的发现等染色体结构异常的研究中。然而相对于发生异常频率最高的整条染色体数目发生变化的非整倍体检测来说，采用这两项技术的综合成本较高，给患者造成了较大的经济负担， 也影响了自身在临床上的广泛应用。PCR技术的出现使分子生物学迈入一个新的时代。基于PCR技术的诊断方法也以其操作简便、低成本、高通量、易自动化等优势弓I起人们的广泛兴趣。最早应用于染色体非整倍体的产前诊断的这类方法是定量PCR(Quantitative PCR) (Von Eggeling F，Freytag Μ, Fahsold R, et al. Hum Genet，1993，91 :567-70)，这项技术的原理是选取特定染色体上的短串联重复序列(Small-tandem-r印eat，STR)的两端序列作为引物结合位点，对STR序列进行扩增，然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析。该方法的优点是准确性高，无需细胞培养，诊断可在一天内完成。它的不足之处在于有的同源染色体可能含有相同长度的STR序列，因此一个STR序列对于精确诊断就有所不足，通常会同时对一个染色体上的4个或以上STR序列进行分析。这就增加了扩增反应的重数，增加了扩增的难度。 同时，不同人种的STR序列也有差别，适合于某一人种的STR诊断组合并不一定适合另一人种，因此需要重新设计扩增位点，增加了实验难度。近几年来，一种新的多重探针连接再扩增技术(Multiplex ligation-d印endent probe amplification, MLPA) (Schouten JP, McElgunn CJ, Waaij er R, et al. Nucleic Acids Res, 2002, 30 :e57)以其耗时短和较高的准确性赢得了诊断界的青睐，与QF-PCR — 样获得了广泛的应用。国内一些医院在近几年也弓I入了该技术用于传统染色体组型分析方法的辅助分析。该方法的创新之处在于采用杂交连接的方法将不同染色体间数目的比例转化为不同杂交探针数目的比例，并使用一对扩增引物进行扩增，消除了因为不同引物扩增效率不同而引起的误差，大大增强了实验结果的准确性。并且通过stuffer序列和核酸测序仪的使用，大大提高了分析的通量，从而可以在一条染色体上分析多个位点，也增加了结果的准确性。但是，由于杂交探针的长度较长，超过了化学合成的范围，只能通过M13噬菌体克隆获得，增加了技术难度和成本。同时PCR产物的后处理使得PCR产物造成的交叉污染难以避免。测序仪器分析同样增加了仪器、试剂的成本和工作量。以上因素限制了这项技术临床的普及。实时荧光PCR技术(Real-time PCR)使PCR技术摆脱了琼脂糖与毛细管电泳的束缚，迈上一个新的阶梯。它的基本原理是通过荧光标记的寡核苷酸探针或嵌入式荧光染料结合相关仪器实时获得PCR扩增反应的动力学曲线，通过Ct值(产物荧光值到达设定阈值所需的反应循环数)即可获得初始模板的相对或绝对数量信息。无需电泳等PCR产物后处理步骤，且由于扩增初始误差未被放大，因此比终产物定量的方法更加准确。实时定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)(Zimmermann B, Holzgreve W, Wenzel F, et al.Clin Chem, 2002 ；48 :362-本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李庆阁，郭奇伟，王小波，黄秋英，夏敏，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：
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