检测染色体病制造技术

在一次试验中检测非整倍性或某些突变，特别是微小缺失所致的多种染色体病中的任一种的方法和使用该方法的试剂盒。利用多对引物寡核苷酸进行聚合酶链式反应（ＰＣＲ）来扩增真核基因组ＤＮＡ，其中每对的一条引物在其５端连有可检测标记。多对引物靶向感兴趣的不同染色体的ＤＮＡ区段，所述区段是潜在染色体病的指标，和一对靶向于对照基因的引物。纯化扩增的ＰＣＲ产物，从中得到具有可检测标记的单链ＤＮＡ，使之与微阵列上各含ＤＮＡ寡核苷酸探针的斑点杂交，所述探针的核苷酸序列与各靶区段一条链的核苷酸序列互补。拍摄微阵列各斑点上存在的标记的图像，并通过首先将该图像结果与对照基因特异性斑点的图像作比较，然后与得自正常ＤＮＡ的图像结果作比较来诊断是否存在一个或多个感兴趣的靶ＤＮＡ区段所表明的染色体病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过定量比较表明未知样品中可能丢失或明显突变的整条染色体和/或染色体中某区段的拷贝数，并将这些结果与正常样品作比较来检测非整倍性和突变，特别是微小缺失。更具体地说，本专利技术涉及胎儿染色体病，例如非整倍性，包括三体性21(唐氏综合征)、三体性13、三体性18，和男女性染色体异常，和微小缺失综合征，包括猫叫综合征、威廉斯综合征(Williams-Beuren syndrome)和迪乔治综合征与其它类似疾病的产前检测。
技术介绍
非整倍性是染色体突变的一种常见形式，其中细胞中各染色体数目比正常细胞中的数目增加或减少。互补的二倍体(diploid complement)中缺少一条染色体称为单体性，而存在额外的一条染色体称为三体性。三体性21是存在一条额外的染色体21，它是非整倍性最常见的形式，导致唐氏综合征，一种潜在的严重智力迟滞的先天性疾病。当存在适应症时，联用核型与羊水或绒毛膜绒毛样品作产前染色体病诊断已成为全世界高度发达国家的标准方法。核型是能特征鉴定互补染色体状态指征的集合；包括染色体总数、各型染色体的拷贝数和染色体形态。一般通过染色中期(或凝聚的)染色体来测定核型。因为直至近来分裂间期染色体因其分散状态和对染色技术不灵敏而无法目测，所以常用中期染色体。中期染色体可采用多种细胞学技术染色，染色后显示为纵向区段，通常称为条带。各染色体的带型是独特的，从而可明确鉴定含有任何异常的染色体。然而，这种分析需要培养细胞并制备高质量的中期染色体，可能要花1-3周。有人试图不经培养细胞来分析染色体，美国专利号5,447,841描述了一种这样的方法。利用与存在于未培养的间期羊水细胞上的染色体特异性DNA靶(序列)的荧光原位杂交(FISH)获得了快速的部分核型分析。在该方法中，荧光标记的探针与结合在固体支持物上的染色体的互补位点杂交。该方法克服了常规细胞学染色方法因缺乏足够特异性的染色体染色所致的限制；提供了含有标记核酸片段的异质性混合物的试剂，该试剂可与特定染色体、染色体的特定亚组或特定染色体的特定亚区的DNA杂交。虽然FISH方法开创了能快速且高灵敏度地检测中期和间期细胞染色体病的可能性，但它还是有一些缺点1)许多微小缺失相关的染色体病因缺乏信号灵敏度而仍需要中期染色体和2)许多可同时诊断的染色体受限于荧光显微镜滤片分辨率。此外，进行FISH方法需要高度熟练的技术人员和昂贵的仪器与试剂。通过共同扩增第二种无关模板的PCR来定量测定cDNA种类的方法已有描述，参见Rappolee，D.A.等，Science，241708-712，(1988)。该方法极其依赖某些变量，包括循环次数和各种起始mRNA的用量。即使充分控制这些变量，也不可能精确地使无关对照模板的扩增速率与未知模板相同。两种模板扩增速率中微小的差异在PCR期间被放大，从而非常可能高估或低估所用的最终试验中存在的未知模板的含量。Amhelm，Norman等，在“聚合酶链式反应”，Chemical & EngineeringNews，36-47，(1990年10月1日)中报导说PCR已用于遗传疾病的产前诊断来分析胎儿DNA以确定其是否含有可导致该疾病的突变形式的基因。PCR扩增后，利用标记探针测试PCR样品中是否存在导致疾病的等位基因。其报导说可在一份样品中测定是否存在几种不同的导致(疾病)的基因。该报道还表明在利用斑点印迹方式发现病原的检测方法中，PCR检测方法已利用了基于酶、化学发光物质和荧光物质的报导物，将PCR扩增产物点样在尼龙膜上，然后使携带点样斑的该膜与能和感兴趣PCR产物特异性退火的单链DNA探针接触，所述探针经放射性标记或用可被荧光物质或化学发光物质检测的分子来标记。该方法的局限是一次(只能)筛检一种分析物。所描述的另一种方法是通过PCR在不干扰引物与靶(分子)退火或被聚合酶延伸的能力的核苷酸侧链中加入一标记来标记病原特异性产物本身。(该方法)提到了可通过一短的接头臂将引物的5端或引物序列内的碱基之一与荧光染料，例如荧光素或维生素(生物素)连接而监测。然后提出合适的扩增PCR产物制备后，可用连接于固体支持物的非标记病原特异性探针“捕获”来检测该产物。由Cetus Corporation开发的该备选方法称为反向斑点印迹法。将所有过量的标记引物等洗去后，通过与细菌蛋白质链霉亲和素结合，然后用酶处理来检测是否存在分析物。所提出的另一种捕获(方法)是用荧光染料标记一种引物，用生物素标记另一种引物，然后用链霉亲和素捕获双链产物并检测荧光。(该文献)提到此捕获方法可利用不同的具体病原引物组(其中一种引物被标记)来同时检测不同的诊断性序列。(该文献)提出使总的PCR产物与具有不同区域的合适尼龙膜支持物杂交，其中每个区域含有对一种病原的PCR产物特异性捕获探针。杂交后用严谨条件洗涤支持物，如果标记物是生物素，可依次加入链霉亲和素-酶复合物与合适的酶底物在该特定区域中产生颜色而表明是否存在一种病原体。(该文献)提出此方法优于包括多步操作的原始斑点印迹法，因为后者需要在不同的杂交实验中用各种标记的病原特异性探针来测试未标记的不同PCR产物的等份试样。授予Bunn等的美国专利号5,213,961公开了采用竞争性方法的定量PCR法，其中讨论了影响DNA扩增的参数和区分模板(测试和对照)比值与拷贝数差异的机制。(该文献)提出此方法可用于检测体细胞突变。Bunn等阐述了主要由DNA引物和它们各自的引物结合位点性质所致的各种参数对扩增方法的影响；然而，该系统的局限在于利用了与靶(分子)足够接近的标准品从而使PCR以相同速率共同扩增靶(分子)和样品。此外，标准品必须不同于靶(分子)而可在以后通过酶促作用改变其长度，进而通过电泳分离并定量测定标准品和靶(分子)。PCT公布的申请WO 94/03638公开了利用存在于染色体DNA中的短串联重复性DNA序列和用于扩增该短串联重复性序列的PCR方法来检测非整倍性的其它方法。授予Han的美国专利5,888,740在PCR反应期间利用经工程改造作为内部标准品的DNA模板来定量测定基因组DNA的水平。设计的这些对照DNA模板具有与测试样品DNA模板相同的PCR反应引物序列。扩增的目标是以相同的速率进行，从而可控制扩增速率。然而，该方法每种染色体需要特定的内部对照，因而是复杂。此外，各染色体的PCR反应必须在微滴定板的不同孔中或其它容器中进行。授予Carey的美国专利号6,551,783说明了一种基于在同时PCR试验中定量测定两种靶基因表达的方法，该试验所用的系统中荧光标记或报导探针从被扩增的DNA链上取代，其方式是荧光探针离开了邻近的猝灭染料。通过利用两种不同的荧光探针，可同时进行两种基因的多重PCR。一种靶基因是普遍表达的标记基因，例如GAPDH或DAD-1。所述方法局限在于一次(只能进行)一种未知靶(基因)的测定。WO 94/23023所述的另一方法根据对某靶基因、看家基因和它们的含有突变(例如，点突变、插入或缺失)的竞争性模板进行多重PCR来定量测定该靶基因。此方法复杂且费事，在最后的分析中还要利用凝胶电泳。就同时筛检多种疾病而言，上述筛检染色体疾病的方法无一令人完全满意，因此仍要找寻易于使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在一次试验中检测多种染色体病中任一种的方法，所述方法包括以下步骤：ａ在容器中混合以下组分来制备聚合酶链式反应（ＰＣＲ）混合物：（ｉ）真核基因组ＤＮＡ；（ｉｉ）多对正向和反向ＤＮＡ引物寡核苷酸，其中所述每对引物的一 条与该真核ＤＮＡ第一ＤＮＡ链的靶区段３序列互补，另一条引物与该靶区段第二链的３序列互补，该真核ＤＮＡ区段长约５０－３００个碱基对，其中每对引物的一条在其５末端连接有可检测标记，多对引物各自靶向所选择的感兴趣的不同染色体的区段，该区段是潜在染色体病的指标，并有一对引物靶向对照基因的区段；和（ｉｉｉ）进行ＰＣＲ扩增所需的ＰＣＲ缓冲液和酶；ｂ进行有约５－６０轮温度循环的ＰＣＲ，产生扩增的ＰＣＲ产物；ｃ纯化步骤（ｂ）的所述产物，获得含有可检测标记的单链ＤＮＡ； ｄ使微阵列与步骤（ｃ）的产物接触，所述微阵列具有多个斑点，各斑点含有的ＤＮＡ寡核苷酸探针的核苷酸序列与所述各靶区段的所述链之一的核苷酸序列互补；ｅ使所述ＤＮＡ寡核苷酸探针与所述ＰＣＲ－扩增的含标记单链产物杂交；ｆ拍摄 该微阵列的图像来检测是否存在与该微阵列杂交的ＰＣＲ－扩增产物及其相对含量；和ｇ将所述微阵列上所选择染色体的所述各靶区段相关斑点的图像与所述对照基因相关斑点的图像作比较，然后与已知正常的基因组ＤＮＡ的类似测定所得结果相比较，来诊断是否 存在与一种或多种所述选择的不同染色体有关的染色体病。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：Z谢，S韩，T瓦达那斯库尔，
申请(专利权)人：生物概念股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]