用于检测核酸序列变体的方法技术

本发明专利技术提供用于检测靶区内是否存在核酸变体的方法。这些方法包括在选择子阻断剂(selector blocker)的存在下用正向引物和反向引物扩增所述靶区。所述选择子阻断剂包括在没有所述核酸变体时与所述靶区互补的序列。所述方法还包括检测所述靶区的扩增，此处所述靶区的扩增指示所述靶区中的所述核酸变体的存在。所述核酸变体可包括缺失、突变或插入。

【技术实现步骤摘要】
用于检测核酸序列变体的方法本申请是申请号为201280032293.0，专利技术名称为“用于检测核酸序列变体的方法”的专利技术申请的分案申请。专利
本专利技术涉及用于检测靶核酸序列中核酸变体的方法和用于高保真序列扩增的方法。背景核酸变体的检测对多种情况而言是重要的，其对疾病的检测和预后极其重要。目前，就检测核酸变体而言有广泛的试验形式。此类试验包括焦磷酸解作用激活的聚合(PAP)、使用LNA阻断剂的试验和cast-PCR试验。焦磷酸解激活的聚合反应(PAP)可用于检测突变负荷或检测微小残留病。在PAP中，焦磷酸解和DNA聚合酶的聚合反应可通过使用焦磷酸解可激活的寡核苷酸(P*)来有序偶合。所激活的P*可通过DNA聚合作用来延伸。该试验的特异性由焦磷酸解作用和聚合作用共同产生，因为显著的非特异性扩增需要错配焦磷酸解和由DNA聚合酶的错误掺入相结合，而这是极端罕见的事件。(参见，例如，Liu和Sommer,“Pyrophosphorolysis-activatedpolymerization(PAP):applicationtoallele-specificamplification(焦磷酸解激活的聚合反应(PAP)：在等位基因特异性扩增中的应用),”Biotechniques,29(5):1072-6,1078,1080(2000)；通过引用全文纳入本文)。LNA阻断剂也可用在检测和/或定量核酸群中核酸变体的方法中，所述核酸群中野生型核酸丰度较高。这类方法使用高亲和力的短寡核苷酸，所述寡核苷酸靶向野生型而不是少数或突变序列，并起到阻断野生型DNA检测的功能。所述LNA阻断剂探针可与较长的检测探针或PCR引物联用以扩增和/或鉴定所述少数或突变序列。(参见，例如，美国专利申请号20100009355；其通过引用全文纳入本文)。Cast-PCR也可用作分析不同等位基因之间序列变异的试验。所述方法使用竞争性等位基因特异性TaqManPCR(“cast-PCR”)来区分核酸变体。Cast-PCR采取在靶核酸序列上进行两个扩增反应。第一反应包括在第一等位基因特异性引物和第一等位基因特异性阻断剂存在下扩增，然后检测扩增产物，所述第一等位基因特异性阻断剂与所述第一等位基因变体互补。第二反应包括在第二等位基因特异性引物和第二等位基因特异性阻断剂存在下扩增，然后检测扩增产物，所述第二等位基因特异性阻断剂与所述第二等位基因变体互补。(参见，例如，美国专利申请号20100221717；其通过引用全文纳入本文)。上述方法全部都具有不同的难点和局限。用于检测罕见变体的这些方法背后的一个共同问题是酶保真度欠佳。不易区分在复制和相关扩增过程中引入的误差和真实的罕见变体与突变，从而削弱了这些方法的性能。此外，在等位基因特异性引发的情形，例如扩增阻碍突变系统(ARMS,NucleicAcidsRes.17:2503-16(1989))中，扩增中的错误引发会“覆写(over-write)”变体位点并导致欠佳结果。在大多数情况中，上述方法的特异性局限于0.1～5％的等位基因普遍性。甚至在下一代测序方法中也有这种情况，因为使用的聚合酶所引入的差错足以将罕见等位基因检测的灵敏度限制到约3～5％。所有这些试验的关键难题在于，它们的核心是使用DNA聚合酶的扩增方法，这些方法因为失真而引入差错，造成固有背景在1～3％范围或更大，这取决于聚合酶。有少许方法能够获得高得多的特异性水平，例如数码PCR，但是这些方法复杂、昂贵，并且不易于和确证试验或诊断试验交互。并且，数码PCR自身还不适于高度多路复用。本领域需要能够更有效地检测罕见核酸序列变体的其它试验方法。此外，需要减少与聚合酶相关扩增系统有关的掺入差错的方法。需要开发其它方法，而本专利技术的方法就提供这种其它试验方法。
技术实现思路
本专利技术提供用于检测靶区内是否存在核酸变体的方法。这些方法包括在选择子阻断剂(选择子阻断剂)的存在下用正向引物和反向引物扩增所述靶区。所述选择子阻断剂包括在没有所述核酸变体时与所述靶区互补的序列。所述方法还包括检测所述靶区的扩增，其中所述靶区的扩增指示所述靶区中的所述核酸变体的存在。所述核酸变体可包括缺失、突变或插入。本专利技术方法还可提供>1:1000的灵敏度(即，可在1000个拷贝的野生型靶区存在下检测到所述靶区中1个拷贝的核酸变体)。在一些实施方式中，所述灵敏度是>1:1500、>1:2000、>1:2500、>1:3000、>1:3500或>1:4000、>1:5000、>1:10,000、>1:20:000、>1:50:000、>1:100,000、>1:120,000、>1:150,000、>1:200,000、>1:250,000、>1:500,000、>1:750,000、>1:1,000,000或更高的灵敏度。所述方法还可额外包括与选择子阻断剂一同使用报告子探针。所述报告子探针在存在扩增时提供第一信号，在没有扩增时提供第二信号。本专利技术还提供反应混合物，所述反应混合物包含正向引物、反向引物、选择子阻断剂和模板多核苷酸，所述模板多核苷酸包含可有核酸变体的靶区。所述选择子阻断剂包括在没有所述核酸变体时与所述靶标区域互补的序列。所述正向引物和所述反向引物可用于扩增所述模板多核苷酸包含所述靶区的区域。所述反应混合物可额外包含报告子探针，其中所述报告子探针在存在扩增时提供第一信号，在没有扩增时提供第二信号。本专利技术还提供用于进行高保真扩增的方法，在一些实施方式中，所述方法包括将核酸酶耐受引物与高保真聚合酶联用于核酸靶区的扩增。本专利技术还提供试剂盒。本专利技术设想的试剂盒可包含正向引物和选择子阻断剂。所述选择子阻断剂包括在没有所述核酸变体时与所述靶标区域互补的序列。所述正向引物包含与所述靶区的上游区域互补的序列。所述试剂盒还可包含反向引物和报告子探针。还设想试剂盒包含核酸酶耐受引物和高保真聚合酶和含有3’外切核酸酶活性的修复酶。本专利技术还涉及下述各项：1.一种用于检测靶区内是否存在核酸变体的方法，所述方法包括在选择子阻断剂的存在下用正向引物和反向引物扩增所述靶区，其中所述选择子阻断剂包含除在所述核酸变体出现的位置以外与所述靶区互补的序列，检测所述靶区的扩增，其中所述靶区的扩增指示所述靶区内所述核酸变体的存在。2.如项1所述的方法，其特征在于，所述核酸变体包括缺失、突变或插入。3.如项1所述的方法，其特征在于，所述选择子阻断剂是不可延伸的。4.如项1所述的方法，其特征在于，所述选择子阻断剂被构建为开关阻断剂。5.如项1所述的方法，其特征在于，所述选择子阻断剂和正向引物彼此连接或接合成引物-开关。6.如项1所述的方法，其特征在于，所述选择子阻断剂被保护以抵御3’或5’外切核酸酶活性。7.如项1所述的方法，其特征在于，所述选择子阻断剂对靶序列的亲和性增加。8.如项1所述的方法，其特征在于，所述选择子阻断剂不包含PNA或LNA。9.如项1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物开关，其包含与选择子阻断剂共价或非共价连接或接合的正向引物，其中所述正向引物和选择子阻断剂各包含一种或多种核酸变体存在或不存在下与靶区中的序列互补的序列。

【技术特征摘要】
2011.05.04 US 61/482,5761.一种引物开关，其包含与选择子阻断剂共价或非共价连接或接合的正向引物，其中所述正向引物和选择子阻断剂各包含一种或多种核酸变体存在或不存在下与靶区中的序列互补的序列。2.权利要求1的引物开关，其中所述正向引物和选择子阻断剂经由交联剂或S18间隔子共价或非共价连接或接合。3.权利要求1的引物开关，其中所述选择子阻断剂包含所述核酸变体不存在下与所述靶区中的序列互补的序列。4.权利要求1的引物开关，其中所述正向引物和选择子阻断剂包含相同的序列。5.权利要求1的引物开关，其中所述正向引物和所述选择子阻断剂各具有与相同靶区互补的序列，不同之处在于，它们在出现核酸变体的一个或多个位置上有不同。6.权利要求5的引物开关，其中所述正向引物具有与所述靶区(出现核酸变体的位置除外)互补的序列，且所述选择子阻断剂具有所述核酸变体存在下与所述靶区互补的序列。7.权利要求5的引物开关，其中所述正向引物具有与包含核酸变体的靶区互补的序列，且所述选择子阻断剂具有所述变体不存在下与靶区互补的序列。8.权利要求1的引物开关，其中所述引物开关通过下述生成：使用3’至5’化学合成所述正向引物，插入至少一个S18间隔子，并使用5’至3’化学逆转链的方向以合成所述选择子阻断剂。9.权利要求1的引物开关，其中所述引物开关进一步包含可检测的实体。10.权利要求9的引物开关，其中所述可检测的实体选自下组：荧光标记、化学发光标记和FRET对。11.一种用于检测靶区内是否存在核酸变体的方法，所述方法包括引物开关和反向引物存在下扩增所述靶区，其中所述引物开关包含与选择子阻断剂共价或非共价连接或接合的正向引物，且其中所述选择子阻断剂和所述正向引物各包含与所述靶区中的序列互补的序列，其中(i)所述选择子阻断剂能够与所述靶区紧密结合，从而所结合的引物开关的选择子阻断剂部分作为空间阻断剂预防所述正向引物的延伸，或(ii)由于存在核酸变体所述引物开关的选择子阻断剂部分不能与所述靶区紧密结合，从而所述正向引物能够延伸；且其中所述靶区的扩增指示所述靶区中所述核酸变体的存在且其中所述扩增的不存在指示所述靶区中所述核酸变体的不存在...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·阿诺德，
申请(专利权)人：生物概念股份有限公司，爱吉生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US