本发明专利技术公开了一种重组人IFNα2b乳腺表达载体，该乳腺表达载体是pBCN-IFN-pA-EGFP，它是由扩增所得的beta-酪蛋白启动子和ployA序列、人IFNα2b基因、EGFP的表达盒按顺序ployA-IFNα2b-酪蛋白启动子-EGFP表达盒插入到pMD18-T而得。本发明专利技术还公开了该乳腺表达载体的构建方法。本发明专利技术为利用哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人IFNα2b提供了基础。而且，应用本发明专利技术生产的重组人IFNα2b的生物学活性高、产量大、生产成本低，可产生巨大的经济效益和社会效应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其是一种重组人IFNa 2b乳腺表达载体及其构建方法和应用。
技术介绍
人干扰素2b (IFN α 2b)是一种具有干扰病毒复制，抑制细胞分裂增殖，抑制和杀伤肿瘤等生物学活性的细胞因子，是临床上治疗乙肝、丙肝等病毒性疾病和一些癌症的关键药物。目前，在临床上大量使用的重组人IFNa 2b均为大肠杆菌表达。由于大肠杆菌是原核生物，缺乏与蛋白质翻译后修饰相关的重要酶类，使得所表达的重组人IFNa 2b缺少决定生物活性的化学修饰和空间折叠，直接导致了在治疗效果上的折扣。更严重的是，错误折叠的重组人IFN α 2b在对病人的治疗过程中，会刺激人体产生能中和IFN α 2b的抗体，进一步降低治疗效果。利用哺乳动物细胞系表达IFN α 2b，可以生产具有完全生物活性的重组人IFNα 2b，但此种方式的生产成本过高，且细胞培养条件要求苛刻，表达量低，纯化工艺复杂，远远不能满足IFNa 2b的市场需求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种重组人IFNa 2b乳腺表达载体及其构建方法和应用。解决上述技术问题本专利技术采用如下技术方案重组人IFNa 2b乳腺表达载体，该乳腺表达载体是pBCN-IFN-pA-EGFP。pBCN-IFN-pA-EGFP由扩增所得的beta-酪蛋白启动子和ployA序列、人IFNa 2b 基因、EGFP的表达盒按顺序ployA-IFN a 2b-酪蛋白启动子-EGFP表达盒插入到pMD18_T而得。上述重组人IFNa 2b乳腺表达载体的构建方法，主要包括以下步骤<1>根据GenBank中收录的娟姗牛beta-酪蛋白启动子和ployA序列，Genbank accession No. JN559864，设计引物，并以娟姗牛血液基因组DNA为模板，扩增出beta-酪蛋白启动子和PIoyA序列；<2> 根据 GenBank 中收录的人 IFN α 2b 基因，Genbank accession No. AY255838. 1， 设计引物，并以人血液基因组为模板，扩增获得人IFNa 2b基因；<3>根据BD Biosciences Clontech公司提供的pEGFP-Cl载体的全序列设计引物，扩增出EGFP的表达盒；<4>按顺序将所扩增得到的序列插入到PMD18-T中，顺序为ployA-IFN α 2b_酪蛋白启动子-EGFP表达盒，即得乳腺表达载体pBCN-IFN-pA-EGFP。上述重组人IFNa 2b乳腺表达载体的应用，将该b乳腺表达载体转化到哺乳动物中，以促使其乳腺高效表达重组人IFN α 2b。哺乳动物为小鼠。转化是用Pvu I单酶切pBCN-IFN-pA-EGFP表达载体，切除pMD_18T骨架，回收含有IFN α 2b基因和EGFP基因的片段，回收的基因片段分别溶于无内毒素的TE溶液，调整溶液浓度至2ng/y L，然后注射到小鼠的受精卵的原核中，再将受精卵抑制到同期发情的代孕母鼠输卵管中，产生自代，鉴定，得到转基因小鼠。回收是低熔点琼脂糖凝胶回收，具体是取3 4 μ g酶切的表达载体DNA进行琼脂糖凝胶电泳后，切下需回收的DNA条带所在位置的凝胶，采用Qiagen公司可回收101Λ以上的DNA片段的凝胶回收试剂盒进行回收。本专利技术的重组人IFNa 2b乳腺表达载体及其构建方法，为利用哺乳动物乳腺生物反应器生产重组人IFNa 2b提供了基础。通过胚胎显微操作技术将表达载体转入哺乳动物的基因组中获得转基因动物，从而在转基因动物的乳腺中高效表达重组人IFNa 2b等其他重要的药用蛋白。此种方式成本低(转基因动物的饲养条件、饲料构成与普通动物无异， 不需额外的投入)，乳腺生物反应器产量高和纯化方便(乳汁成分明确，蛋白质种类较少)， 乳汁中的含量为30 μ g/L(约为细胞系表达量的10倍)。对所表达的重组人IFN α 2b生物活性进行检测后发现，比活度约为2. SXlO7IU,并且能在WISH细胞系中显著刺激抗病毒白 MxA的表达。因此，应用本专利技术生产的重组人IFNa 2b的生物学活性高、产量大、生产成本低，可产生巨大的经济效益和社会效应。附图说明图1是重组人IFN α 2b的乳腺表达载体pBCN-IFN-pA-EGFP的构建过程。图2是Pvu I酶切乳腺表达载体pBCN-IFN-pA-EGFP的电泳图，其中，Ml表示 λ DNA/Hind ΠΙ DNA marker。泳道1为Pvu I酶切后的结果，泳道2为环状质粒。M2为 Supercolied DNA ladder marker。乳腺表达载体 pBCN-IFN-pA-EGFP 经 Pvu I 酶切后，可切出两条带，一条为11. Ikb的含有IFNα 2b和EGFP的表达盒。另一条为11Λ的pMD18_T 骨架；图3是PCR鉴定表达载体整合的阳性转基因小鼠的电泳图，其中M表示DNA Iaddermarker III，泳道1，6，7号分别为3只转基因Rnmder小鼠PCR结果，上下两个条带， 分别为两个不同检测引物的扩增结果。其他泳道为见条带，均为阴性小鼠对照；图4是检测转基因小鼠基因组中IFN c^b基因整合的Southern blotting杂交图，其中，M表示11Λ梯度DNA分子量标准，1，6，7泳道分别为3只转基因Founder小鼠，其他泳道均为阴性小鼠对照；图5是PCR鉴定表达载体整合的阳性转基因小鼠的电泳图，其中M表示DNA Iaddermarker III，泳道1-14号均为Fl代小鼠PCR结果，4号泳道的扩增不明显，判定为转基因阴性。BC泳道为空白对照。上下两个条带，分别为两个不同检测引物的扩增结果；图6是检测转基因小鼠基因组中IFNc^b基因整合的Southern blotting杂交图， 其中，M表示11Λ梯度DNA分子量标准，8-13号泳道分别为Fl代转基因小鼠，NC泳道为阴性小鼠对照；图7是检测转基因小鼠乳汁中重组人IFNa沘表达情况的western blotting图， 6,8,9,11，12，13泳道分别为转基因小鼠Fl代乳汁的杂交结果，WT为阴性对照小鼠乳汁的杂交结果，分别用鼠抗人IFNa 2b抗体和鼠抗His标签抗体进行杂交。均在M-25KD处有杂交条带出现；图8是转基因小鼠制备的流程图。图9是转基因小鼠乳汁中重组人IFNa 2b的生物学活性测定。图10是转基因小鼠乳汁中重组人IFNa 2b的比活度的定量测定。具体实施例方式以下所用的载体和试剂来源pMD18_T载体，购自TaKaRa公司，pEGFP-Cl载体， 购自BD Biosciences Clontech公司，引物合成及序列测定均由上海生工生物工程有限公司完成，Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶及荧光定量相关试剂均购自大连TaKaRa公司，鼠抗人IFN α 2b单克隆抗体购自Abcam公司，鼠抗His标签单克隆抗体购自Abmart公司，羊抗鼠HRP酶标二抗购自天根公司。人IFN α 2bELISA检测试剂盒购自R&D公司，人羊膜上皮细胞系WISH细胞购自中国科学院上海细胞库。重组人IFN α 2b标准品购自安徽安科生物。 pGL3-Basic和pRL_TK以及本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种重组人ＩＦＮα２ｂ乳腺表达载体，其特征在于该乳腺表达载体是ｐＢＣＮ－ＩＦＮ－ｐＡ－ＥＧＦＰ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：石德顺，李辉，刘庆友，崔奎青，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：45
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