从转基因非人动物中纯化高级转录复合物制造技术

本发明专利技术涉及含有编码已附加表位的ＴＡＴＡ框结合蛋白（ＴＢＰ）的ＤＮＡ的转基因、表达已附加表位的ＴＢＰ的转基因动物的产生和使用它们从各种类型的真核组织和细胞亲和纯化（新型的）转录因子和转录复合物。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及含有编码已附加表位的TATA框结合蛋白(TBP)的DNA的转基因、产生表达已附加表位的TBP的转基因动物和使用它们从各种类型的真核组织和细胞亲和纯化(新的)转录因子和转录复合物。对真核转录过程的调节重要的是前起始复合物的逐步形成和活性。此复合物是一种大的多亚基复合物，对于RNA聚合酶II酶在转录起始点的正确定位和起始是必需的。在最近几年，从真核生物的核中鉴定了这种复合物的许多一般转录因子(GTFs)，包括TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH(Zawel和Reinberg(1995)生物化学年度综述64，533-561；Serizawa等(1994)，“转录机制和调节”，45-66，Raven出版社)。在含有TATA的启动子中，TFIID和TATA框序列具有特异性的亲和性。正是通过这种序列识别出TFIID是在基础RNA聚合酶II转录中结合启动子的首要因素，因此是形成复合物的核心(Lewin，B.(1990)细胞.611161-1164)。其它的GTFs以确定的逐步的方式结合，产生了整个前起始复合物。其后，这种大的复合物在转录起始点征集并且使RNA聚合酶II(Pol II)正确定位以开始基础转录。因此，可以看出本身为多亚基复合物的TFIID在调节″活化的转录″中起关键作用，也可以说成在转录激活物的存在下mRNA的产生水平提高了。这样的激活物可以是天然存在的结合增强子的决定簇(如结合E框的USF(Sawadogo和Roeder(1985)细胞43165-175；Kirschbaum等(1992)分子细胞生物学125094-5100))或病毒因子(例如VP16(Stringer等(1990)自然345783-786))。TFIID是由结合TATA的蛋白质(TBP)和一些TBP相关性因子(TAF11s)(在本申请中″TAF11s”包括任何种类的转录因子、转录激活物、转录抑制剂)组成的。到目前为止已经鉴定了多达20种不同的TAF11s，同时观察到了含有TAF11s不同组合的TFIID复合物(Zawel和Reinberg(1995)生物化学年度综述64533-561；Hori，R.和Carey，M.(1994)当代遗传学的最新发展4236-244)。此外，TAF11s的不同组合导致了TFIID复合物不同的性质。例如，在果蝇属中，模式形成蛋白质Hunchback(HB)和Bicoid(BCD)完全依靠TFIID复合物中的TAF1160、TAF11110和TAF11250的存在(Sauer，F.等(1995)科学270，1783-1788)。这些TFIID组分作为上游结合增强子的HB和BCD蛋白质的共激活物。已经表明神经原因子NTF-1需要TBP、TAF11150(NTF-1与之结合)和TAF11250的最小复合物来激活转录，而SP1需要附加的因子TAF11110来激活(Chen，J.-L.等(1994)细胞7993-105)。另一个研究确定了TAF1128，它的存在对于转录激活(通过雌激素与维生素D3核受体)是必需的(May，M.等(1996)EMBO 15.3093-3104)。很可能TAF11s作为转录衔接子通过蛋白质-蛋白质相互作用从活化剂/阻遏物因子向核心起始复合物传递调节信息。从目前转录的调节来看，单个基因和/或密切相关基因座小组的表达是由一定数目的转录复合物的亚基控制的。尽管一些因子在大多数转录过程中是普遍存在的(例如GTFs)，但是人们描述了数量不断增加的调节转录的基因和细胞特异性因子。已经存在一些被证明的用于鉴定转录因子的方法。揭示RNA Pol II和七个GTFs(TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、和TFIIJ)的先前的方法主要包括细胞系中的核制剂的柱分级分离(Zawel和Reinberg(1995)；Serizawa等(1994)；Roeder，R.G.(1996)TIBS 21327-335)。这些组分产生能够转录的各种半纯化的蛋白质。这些组分的大多数看来似乎对基础转录来说是完全必要的。在这一点上，已知TFIID组分负责识别TATA框。然而，没能成功地分离出能够结合TATA的单一蛋白质。当发现单一组分的酵母显示出在重建基础转录分析中能够代替TFIID，其能进行27kD的结合TATA的蛋白质(TBP)的分离与克隆，那么就会发生突破(Buratowski，S.等(1988)自然33437-42；Cavallini，B.等(1988)国家科学院学报869803-9809)。使用简并的引物对人TBP亚单位和小鼠TFIID的基因进行进一步鉴定((Kao，C.C.等(1990)科学2481646-1649；Hoffmann，A.等(1990)自然346387-390；Peterson，M.G.等(1990)科学2481625-1630)，Drosophila(Hoey，T.等(1990)细胞611179-1186；Muhich，M.L.等(1990)国家科学院学报87，9148-9152)；(Tamura，T.等(1991)核酸研究193861-3865))。从不同物种能够得到TBP的cDNA使得各种各样的研究(包括在细胞培养物中过量表达这些蛋白质)成为可能。产生的HeLa细胞系在组成上表达了TBP蛋白质，该蛋白质具有FLAG-尾或者流感病毒血凝素(HA)附加表位加入到它的氨基末端(Zhou，Q.等(1993)基因和发展7，180-187，Chiang等(1993)EMBO 12，2749-2762)。FLAG-尾是由八个氨基酸的合成序列组成的表位。HA-尾是具有SEQ ID NO.1“MGYPYDVPDYAV”(单字母代码)的氨基酸序列的天然表位。也将来源于天然的HA尾(来源于流感病毒血凝素的10个氨基酸)的较短的肽用于在果蝇属细胞系中表达含有TBP的融合蛋白上(Colgan和Manley(1992)，基因发展.6，304-331；Trivrdi等，(1996)分子细胞生物学16，6909-6916)。在细菌中已经表达了氨基末端具有两个附加表位(FLAG-和HA-表位)的TBP蛋白质(Chiang等(1993)EMBO 122749-2762)。在诱导型启动子的控制下也表达了已附加FLAG的TBP蛋白质(Wu等，(1996)生物技术21718-725)。然而，将抗表位/表位的单克隆抗体用于从核提取物中纯化TBP相关性复合物，这样共纯化TFIID复合物的TBP相关性因子(TAF11s)(Zhou等，(1993)遗传学发展。7180-187)。随着最近从HeLa核提取物和酵母中鉴定新的TAFs和TAF-相互作用因子，许多实验室按照这些方法继续研究(Hori和Carey(1994)遗传学的最新发展.4236-244；Zawel和Reinberg(1995)生物化学年度综述64533-561；Roeder，R.G.(1996)生物化学科学发展趋势21，327-335)。在人体中鉴定了TAFs TAF1168、TAF1155、TAF1130、TAF1128、TAF1220和TAF1118(Mengus等(199本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够表达已附加表位的ＴＡＴＡ框结合蛋白（ＴＢＰ）的转基因非人动物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：B克什巴姆，E比格伦德，M梅斯特雷斯特，G泼里特斯，
申请(专利权)人：赫彻斯特股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]