一种ＬＭＰ２Ａ蛋白来源的ＨＬＡ－Ａ２限制性表位多肽，它是多肽ＬＭＰ２Ａ↓［２６４］，由九个氨基酸组成，其位置为２６４－２７２，其序列为：ＱＬＳＰＬＬＧＡＶ。发明专利技术人表达、鉴定和纯化了分枝杆菌热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０），构建了评价ＥＢＶ相关多肽疫苗体内试验的转基因动物模型。系统研究了ＥＢＶ新表位多肽ＬＭＰ２Ａ↓［２６４］在健康志愿者和转基因小鼠体内外诱导ＥＢＶ特异性的ＣＴＬ的免疫学研究，评价了多肽ＬＭＰ２Ａ↓［２６４］对ＬＭＰ２Ａ阳性实体瘤肿瘤预防和肿瘤治疗试验，证明多肽ＬＭＰ２Ａ↓［２６４］在体内外均可以诱导ＬＭＰ２Ａ特异性细胞毒性Ｔ淋巴细胞反应。因此，本发明专利技术的多肽ＬＭＰ２Ａ↓［２６４］可以应用于制备治疗或预防ＬＭＰ２Ａ阳性实体瘤的药物。
【技术实现步骤摘要】
LMP2A蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽及其用途
-本专利技术涉及一条LMP2A蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽，及其在实体瘤的治疗及预防中的应用
技术介绍
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)属疱疹病毒科丫亚科成员，由Epstein和Barr于1964年首次从非洲儿童淋巴瘤中分离得到，全球约95%的人感染过EBV并成为携带者。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是与EBV感染高度相关的上皮细胞来源的恶性肿瘤，为头颈部常见肿瘤之一。NPC高发于东南亚及我国华南地区。江苏目前发病率也在不断增高，平均每周新增病例10 20例，每年约960例新发病例。临床上NPC不能手术治疗，主要是通过放疗和化疗，但这种治疗方法并不能完全有效地清除肿瘤细胞，而且副反应较大，部分患者易复发和转移。因此在传统治疗方案的基础上加以生物治疗，发展以细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)为基础的免疫治疗己成为目前研究的方向。病毒蛋白在NPC肿瘤细胞中呈潜伏II型表达，即仅表达EBV核抗原(EBNA1)和EBV潜伏膜蛋白(LMP1、 LMP2)。 LMP2是一个包含12个跨膜区域的疏水膜蛋白，由LMP2A和LMP2B组成，两者mRNA仅N端第1个外显子不同，共享C端2 9个外显子，LMP2A表达量远高于LMP2B。 LMP2A是静止B细胞中唯一可检测到的EBV潜伏期基因表达产物，可增强细胞周期诱导和凋亡抑制等相关基因的表达，改变DNA和RNA新陈代谢相关基因表达，减少B细胞特异性因子和免疫相关基因的表达。研究表明，LMP2A蛋白富含HLA-A限制性CTL的抗原决定簇，诱导机体产生LMP2A表位特异性的CTL，能特异性杀伤表达LMP2A的相关肿瘤细胞。加之LMP2A其本身不是转化基因，但在EBV潜伏感染及转化细胞中发挥了重要作用，是EBV相关肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。在NPC的免疫治疗中，以LMP2A为靶抗原设计的表位多肽治疗性疫苗已成为目前研究的热点。表位肽疫苗的优点在于化学性质稳定、制备方便、不需细菌或病毒等载体、根据需要可设计成特异性或通用性疫苗。随着生物信息学的发展，以往通过合成大量交叠肽(overlap peptides)再利用后续实验加以筛选的方法己逐步被计算机预测方法取代，极大地加快了基于表位的疫苗设计进程。随着研究的不断进行，陆续有新的LMP2A特异性表位被鉴定出来。免疫原性弱和诱导免疫耐受是当前表位疫苗研究面临的主要问题，新的研究发现导致免疫耐受的原因主要与传统短肽的提呈途经有关。van der Burg在传统的MHC-I限制性表位序列基础上，添加锚定序列和连接序列，体外合成长肽，发现长肽在提高免疫原性和克服免疫耐受方面明显优于传统的短肽，其开发的HPV相关疾病治疗性多肽疫苗已经进入III期临床试验。研究新型抗原佐剂、选择合适的抗原提呈细胞和对抗原肽进行修饰加工是表位疫苗研究的热点。热休克蛋白(heat shock protein, HSP)家族具有结合多肽、稳定多肽(分子伴侣)、转运多肽的作用。新近发现树突状细胞(dendritic cell, DC)表达HSP70受体，多肽与HSP70形成的复合物可通过受体介导的高效抗原内吞作用被捕获，结合的多肽被递呈至MHC分子，激发特异性T细胞免疫应答。分枝杆菌HSP70还能刺激DC表面的共刺激分子的表达与细胞因子的分泌，在连接天然免疫和获得性免疫中发挥了重要的桥梁作用，被公认为"天然免疫佐剂"。
技术实现思路
本研究的目的是筛选并鉴定LMP2A特异性CTL表位肽，将其或配合适宜的免疫佐齐U，作为一种新的表位疫苗，直接免疫机体，用于替代较为繁琐的重组病毒载体免疫疗法和树突状细胞过继免疫疗法。一种LMP2A蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽，它是多肽LMP2A264，由九个氨基酸组成，其位置为264-272,其序列为QLSPLLGAV。本研究采用生物信息学与体外实验相结合的方法，筛选并鉴定了三条有效的HLA-A2限制性的LMP2A特异性的表位，分别是LMP2A264 (QLSPLLGAV)、 LMP2A426(CLGGLLTMV)和LMP2A356 (FLYALALLL)。其中LMP2A264 (QLSPLLGAV)为本实验在中国人群中首次鉴定的新的LMP2A特异性表位。在EBV健康携带者和NPC患者中的体外实验结果显示这三条肽段均可以有效的诱导CTL反应，杀伤表达LMP2A蛋白的特异性靶细胞。多肽LMP2A264可以按多肽一般的合成法合成，如多肽固相Fmoc合成法合成，该4合成法的固相载体可以选用羧基树脂，如王氏树脂。可以用多肽自动合成仪合成。专利技术人之前进行了 LMP2A重组腺病毒和痘苗病毒载体疫苗及树突状细胞(dendriticcell, DC)疫苗的研究，但这两类疫苗存在一定的缺陷。病毒载体疫苗一类的基因疫苗在使用的安全性上一直存有争议。DC疫苗使用自体外周血单个核细胞体外诱导后获得成熟DC，负载靶抗原后回输给患者，不会产生排异反应，安全可靠，但花费较高的人力和物力，在一定程度上制约了DC疗法的发展与应用。而本研究的多肽疫苗具有化学性质稳定、易于制备、肿瘤识别专一性强、无潜在致癌性等优点，在使用中只需检测一下患者的HLA型别，即可应用对应HLA限制性的多肽进行治疗。本研究鉴定的三条多肽为HLA-A2限制性，因HLA-A2型为中国人群NPC患者最为常见的基因型。LMP2A多肽可制备为干粉状，纯度最高可达98°/。以上，在常温下即可稳定保存，可根据需要制备成合适浓度，联合免疫佐剂(如细胞因子、热休克蛋白等)免疫机体即可达到治疗作用，是一种新型的鼻咽癌免疫治疗药物。专利技术人表达、鉴定和纯化了分枝杆菌热休克蛋白70 (HSP70)，构建了评价EBV相关多肽疫苗体内试验的转基因动物模型。系统研究了EBV新表位多肽LMP2A264在健康志愿者和转基因小鼠体内外诱导EBV特异性的CTL的免疫学研究，评价了多肽lmp2a264对LMP2A阳性实体瘤肿瘤预防和肿瘤治疗试验，证明多肽QLS在体内外均可以诱导LMP2A特异性细胞毒性T淋巴细胞反应。因此，本专利技术的多肽LMP2A264可以应用于制备治疗或预防LMP2A阳性实体瘤肿瘤的药物。该多肽LMP2A264与热休克蛋白形成非共价复合物及相关融合蛋白有增强疗效的作用，所述的热休克蛋白种类包括哺乳动物来源的gp96、 HSP70和分枝杆菌属来源的HSP110、 HSP70、 HSP65。附图说明图1为ELISPOT检测反应性CD8+T细胞IFN-y分泌情况PBMC经rVV-LMP2A-DC诱导获得LMP2A特异性CTL，与负载不同多肽的自体DC共孵育，ELISPOT法检测IFN-y的分泌。根据平均SFC/5xl04CD8+T (右)和SI值(左)评估特异性CTL的应答强度。其中1:多肽QLS; 2:多肽ALL; 3:多肽CLG;4:多肽KLL; 5:多肽MLL; 6:多肽FLY图2为NPC患者PBMC经多肽刺激后分泌IFN-y的CD8+T细胞比率NPC患者PBMC经多肽体外刺激后作为反应细胞，与293T-LMP2A细胞共孵育，FACS检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＬＭＰ２Ａ蛋白来源的ＨＬＡ－Ａ２限制性表位多肽，其特征是：它是多肽ＬＭＰ２Ａ↓［２６４］，由九个氨基酸组成，其位置为２６４－２７２，其序列为：ＱＬＳＰＬＬＧＡＶ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚堃，王冰，刘根焰，周锋，谢芳艺，陈云，冯东举，刘英霞，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：84[]
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