转基因动物和使用方法技术

本发明专利技术包括具有包括被引入的部分人免疫球蛋白区的基因组的非人脊椎动物细胞和非人哺乳动物，所述被引入的区包括人VH编码序列和基于非人哺乳动物的内源性基因组的非编码VH序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及转基因脊椎动物，且更具体地涉及用于发展人治疗学的转基因脊椎动物。
技术介绍
在以下论述中，为了背景和介绍的目的，将描述某些文章和方法。被包含在本文中的任何内容不应被理解为“承认”现有技术。申请人明确保留适当时表明本文引用的文章和方法在适用法定条款下不构成现有技术的权利。 编码人和小鼠免疫球蛋白的基因已经被广泛表征。Berman等人(1988) EMBO J. 7 727-738描述了包括Jh基因区段的人Ig ￥11基因座。Sakano等人(1981) Nature290 562-565描述了免疫球蛋白重链基因的多样性区段。Blankenstein和Kruwinkel (1987)Eur. J.1mmunol. 17 :1351-1357描述了小鼠可变重链区。转基因动物例如具有变化的免疫球蛋白基因座的小鼠的产生，允许将这样的转基因动物用于各种研究和开发应用，例如用于药物发现和对各种生物系统的基础研究。带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠的产生被描述在国际申请W090/10077和W090/04036中。W090/04036描述了具有整合人免疫球蛋白“小型(mini)”基因座的转基因小鼠。W090/10077描述了用于产生转基因动物的包含免疫球蛋白显性控制区的载体。已经开发用人免疫球蛋白序列替换内源性小鼠免疫球蛋白区，以产生用于药物发现目的的部分人抗体或完全人抗体的大量方法。这样的小鼠的实例包括被描述在以下中的那些，例如，美国专利第7，145，056号；第7，064，244号;第7，041，871号;第6，673，986号;第 6, 596, 541 号；第 6，570, 061 号；第 6,162, 963 号；第 6,130, 364 号；第 6，091，001 号；第 6，023,010 号；第 5，593，598 号；第 5，877，397 号；第 5，874，299 号；第 5，814，318 号；第5, 789, 650号；第5, 661,016号；第5, 612, 205号；和第5, 591, 669号。完全人源化免疫球蛋白的小鼠中的许多具有低于正常速率的抗体产生，这是由于较低效的V(D)J重组和由部分基因互补(partial gene complement)造成的有限的抗体产生。由于个体小鼠外显子用同线性(syntenic)的人对应物替换的途径，小鼠编码序列已经用人序列“交换”的其他完全人源化免疫球蛋白的小鼠的产生是非常费时的和高成本的。基于前述内容，明显的是，对有效产生人抗体的高效的和有成本效益的方法存在需求。更特别地，本领域中对包括人免疫球蛋白区的非人脊椎动物和具有适当地响应抗原的能力的转基因动物存在需求。根据前述目的，提供了能够产生具有人V区的抗体的转基因非人动物。专利技术概述提供该概述来以简化形式介绍概念的选择，所述概念在下文在详细描述中进一步描述。该概述不意图确定所要求保护的主题的关键或必要特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。从包括在附图中阐明的和所附的权利要求中界定的那些方面的以下书面详细描述，所要求保护的主题的其他特征、细节、实用性和优点将是明显的。本专利技术包括非人脊椎动物细胞和非人脊椎动物，所述非人脊椎动物细胞和非人脊椎动物具有包括被引入的部分人免疫球蛋白区(partially human immunoglobulinregion)的基因组，所述被引入的区包括人免疫球蛋白可变区基因座编码序列和基于非人脊椎动物的内源性免疫球蛋白可变区基因座的非编码序列。优选地，本专利技术的转基因细胞和动物具有内源性免疫球蛋白区的一部分或全部被除去的基因组。最少地，在非人脊椎动物中生产人单克隆抗体要求宿主具有将表达人免疫球蛋白重链蛋白的至少一个基因座和将表达人免疫球蛋白轻链蛋白的一个基因座。 在一些方面，部分人免疫球蛋白可变区基因座包括人Vh编码序列和基于非人脊椎动物的内源性Vh区的非编码Vh序列。在这些方面，部分人免疫球蛋白可变区基因座还包括人D和J基因编码序列和基于非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码D和J基因序列。在其他方面，免疫球蛋白区包括被引入的区，所述被引入的区包括人'编码序列和基于非人脊椎动物的内源性\区的非编码\序列。更优选地，包括人\编码序列的被引入的部分人免疫球蛋白区还包括人J基因编码序列和基于非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码J基因序列。在某些方面，脊椎动物是哺乳动物，且优选地，哺乳动物是啮齿动物，例如，小鼠或大鼠。在其他方面，脊椎动物是禽类，例如，鸡。在一个具体的方面，本专利技术提供了一种用于产生包括部分人免疫球蛋白区的非人脊椎动物细胞的方法，所述方法包括a)将两个或更多个重组酶靶向位点引入非人脊椎动物细胞中以及在包括内源性免疫球蛋白可变区基因座的基因组区的上游将至少一个位点整合入所述细胞的基因组中并在包括所述内源性免疫球蛋白可变区基因座的基因组区的下游将至少一个位点整合入所述细胞的基因组中；和b)将包括人免疫球蛋白可变区编码序列和基于非人脊椎动物宿主的内源性免疫球蛋白可变区的非编码序列的部分人免疫球蛋白可变区基因座经由重组酶介导的交换引入非人脊椎动物宿主细胞中。在该方法的具体的方面，被引入的部分人免疫球蛋白区包括人Vh基因编码区，且还包括i)人D和J基因编码序列和ii)基于非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码D和J基因以及前DJ序列。优选地使用重组酶靶向位点来将部分人免疫球蛋白区引入宿主细胞中，所述重组酶靶向位点在内源性Vh免疫球蛋白基因的上游和内源性D和J基因区的下游被引入。在其他方面，Vh基因编码区(至少部分地)源自其他来源-例如，它们可以是合理地或以其他方式设计的序列、是人序列和其他设计序列的组合的序列、或来自其他物种例如非人灵长类的序列。在又一个具体的方面，被引入的部分人免疫球蛋白区包括人\基因编码区，且还包括i)人J基因编码序列和ii)基于非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码J基因序列。优选地使用重组酶靶向位点将部分人免疫球蛋白区引入宿主细胞中，所述重组酶靶向位点在内源性\免疫球蛋白基因的上游和内源性J区的下游被引入。优选地，部分人免疫球蛋白区作为单一核酸被合成，且作为单一核酸区被引入非人脊椎动物宿主细胞中。部分人免疫球蛋白区还可以以两个或更多个毗连区段(contiguous segment)被合成,且以这些离散区段(discrete segment)被引入脊椎动物宿主细胞中。部分人核酸还可以使用重组方法来产生，且在将所述核酸引入非人脊椎动物宿主细胞之前被分离。在另一个优选的方面，该方法还提供在步骤b)之前缺失侧翼为两个被引入的重组酶位点的基因组区。在另一个方面，本专利技术提供了用于产生包括部分人免疫球蛋白区的非人脊椎动物细胞的方法，所述方法包括a)将不能够彼此重组的两个或更多个位点特异性重组位点引入非人脊椎动物宿主的细胞的基因组中，其中至少一个重组位点在内源性免疫球蛋白可变区基因座的上游被引入，且至少一个重组位点在内源性免疫球蛋白可变区基因座的下游被引入；b)提供包括部分人免疫球蛋白区的载体，所述部分人免疫球蛋白区具有i)人免疫球蛋白可变区编码序列和ii)基于宿主细胞的内源性免疫球蛋白可变区的非编码序列，其中所述部分人区侧翼为在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.26 US 61/367,8091.一种具有包括在非人脊椎动物宿主中的被引入的免疫球蛋白区的基因组的转基因非人哺乳动物，所述被引入的区包括人免疫球蛋白可变区编码序列和基于所述非人脊椎动物宿主的内源性免疫球蛋白可变区基因座的非编码序列。2.根据权利要求1所述的转基因动物，其中所述非人脊椎动物宿主的免疫球蛋白可变区基因座中的内源性可变基因的一部分或全部被除去。3.根据权利要求1或2所述的转基因动物，其中所述被引入的免疫球蛋白区基因座包括人Vh编码序列。4.根据权利要求3所述的转基因动物，其中所述转基因动物还包括人D和J编码序列和基于所述非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码D和J序列。5.根据权利要求4所述的转基因动物，其中从所述脊椎动物宿主基因组缺失内源性 VH、D和J序列的一部分或全部。6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的转基因动物，其中所述非人脊椎动物宿主是啮齿动物。7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的转基因动物，其中所述非人脊椎动物宿主是小鼠。8.根据权利要求1、2、3、4或5所述的转基因动物，其中所述非人脊椎动物宿主是鸡。9.一种用于产生包括部分人免疫球蛋白区的非人脊椎动物细胞的方法，所述方法包括a)将两个或更多个重组酶靶向位点引入非人脊椎动物细胞中以及在包括内源性免疫球蛋白可变基因的基因组区的上游将至少一个位点整合入所述细胞的基因组中并在包括内源性免疫球蛋白可变基因的基因组区的下游将至少一个位点整合入所述细胞的基因组中；和b)将包括人编码序列和基于所述非人脊椎动物宿主的内源性免疫球蛋白可变区基因座的非编码序列的部分人免疫球蛋白可变区基因座经由重组酶介导的交换引入所述非人脊椎动物宿主细胞中。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述部分人免疫球蛋白区作为单一核酸区被引入。11.根据权利要求10所述的方法，其中在将所述部分人免疫球蛋白区引入所述非人宿主之前，所述部分人免疫球蛋白区作为单一核酸被合成。12.根据权利要求9所述的方法，其中所述部分人免疫球蛋白区作为两个或更多个毗连的核酸区被引入。13.根据权利要求9、10、11或12所述的方法，其中所述可变基因区是Vh基因区。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述部分人免疫球蛋白区还包括i)人D和J基因编码序列和ii)基于所述非人宿主的内源性基因组的非编码D和J基因以及前DJ序列。15.根据权利要求9、10、11、12、13或14所述的方法，其中所述重组酶靶向位点在所述内源性Vh免疫球蛋白基因的上游和所述内源性D和J基因序列的下游被引入。16.根据权利要求9、10、11、12、13、14或15所述的方法，其中所述重组酶位点与一个或多个选择性标记一起被弓I入。17.根据权利要求9、10、11、12、13、14、15或16所述的方法，所述方法还提供在步骤b)之前缺失侧翼为两个被引入的重组酶位点的基因组区。18.根据权利要求9、10、11、12、13、14、15、16或17所述的方法，其中所述非人脊椎动物细胞是哺乳动物胚胎干(ES)细胞。19.根据权利要求9、10、11、12、13、14、15、16或17所述的方法，其中所述非人脊椎动物细胞是禽类原生殖细胞。20.根据权利要求9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19所述的方法，其中所述方法还提供了选择包括所述部分人免疫球蛋白区的细胞和分离所述细胞。21.一种用于产生包括部分人免疫球蛋白区的非人脊椎动物细胞的方法，所述方法包括a)将不能够彼此重组的两个或更多个位点特异性重组位点引入非人脊椎动物宿主的细胞的基因组中，其中至少一个重组位点在内源性Vh免疫球蛋白区的上游被引入，且至少一个重组位点在所述内源性Vh免疫球蛋白区的下游被引入；b)提供包括部分人免疫球蛋白区的载体，所述部分人免疫球蛋白区具有i)AVh编码序列和ii)基于所述宿主细胞的所述内源性VHg的非编码序列，其中所述部分人区侧翼为在a)的所述宿主细胞的所述内源性VhS疫球蛋白区的侧翼的相同的两个位点特异性重组位点；c)将步骤b)的所述载体以及能够识别所述两个重组酶位点的位点特异性重组酶引入所述细胞中；和d)允许在a)的所述细胞的所述基因组和所述部分人免疫球蛋白区之间发生重组事件，导致用所述部分人免疫球蛋白区替换所述内源性Vh免疫球蛋白区。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一重组酶位点在包括所述内源性Vh免疫球蛋白基因的基因组区的上游被引入，且所述第二重组酶位点在包括所述内源性Vh免疫球蛋白基因的基因组区的下游被引入。23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述部分人免疫球蛋白区还包括i)人D 和J基因编码序列和ii)基于所述非人宿主的所述内源性基因组的非编码D和J基因以及 ItTDJ序列。24.根据权利要求21、22或23所述的方法，其中所述方法还提供了在步骤c)之前缺失侧翼为所述两个被引入的重组酶位点的所述基因组区。25.根据权利要求21、22、23或24所述的方法，其中所述细胞是胚胎干(ES)细胞。26.根据权利要求21、22、23、24或25所述的方法，其中所述方法还提供了选择包括所述部分人免疫球蛋白区的细胞和分离所述细胞。27.一种用于产生包括部分人免疫球蛋白可变区基因座的非人脊椎动物细胞的方法， 所述方法包括a)将不能够彼此重组的两个或更多个位点特异性重组位点引入非人脊椎动物宿主的细胞的基因组，其中至少一个重组位点在内源性'免疫球蛋白区的上游被引入，且至少一个重组位点在所述内源性\免疫球蛋白区的下游被引入；b)提供包括部分人免疫球蛋白区的载体，所述部分人免疫球蛋白区具有i)人\编码序列和ii)基于所述宿主细胞的所述内源性'区的非编码序列，其中所述部分人区侧翼为在a)的所述宿主细胞的所述内源性'免疫球蛋白区的侧翼的相同的两个位点特异性重组位点；c)将步骤b)的所述载体以及能够识别所述两个重组酶位点的位点特异性重组酶引入所述细胞中；和d)允许在a)的所述细胞的所述基因组和所述部分人免疫球蛋白区之间发生重组事件，导致用所述部分人免疫球蛋白区替换所述内源性\免疫球蛋白区。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第一重组酶位点在包括所述内源性\免疫球蛋白基因的基因组区的上游被引入，且所述第二重组酶位点在包括所述内源性' 免疫球蛋白基因的基因组区的下游被引入。29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述部分人免疫球蛋白区还包括i)人叉基因编码序列和ii)基于所述非人宿主的所述内源性基因组的非编码I基因序列。30.根据权利要求27、28或29所述的方法，其中所述方法还提供了在步骤c)之前缺失侧翼为所述两个被引入的重组酶位点的所述基因组区。31.根据权利要求27、28、29或30所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物胚胎干(ES) 细胞。32.根据权利要求27、28、29或30所述的方法，其中所述细胞是禽类原生殖细胞。33.根据权利要求27、28、29、30或31所述的方法，其中所述方法还提供了选择包括所述部分人免疫球蛋白区的细胞和分离所述细胞。34.一种用于产生转基因非人脊椎动物细胞的方法，所述方法包括a)提供具有包括两组位点特异性重组位点的基因组的非人脊椎动物细胞，所述两组位点特异性重组位点不能够彼此重组，且在所述宿主基因组的内源性免疫球蛋白区的一部分的侧翼；b)通过引入识别第一组位点特异性重组位点的重组酶来缺失所述基因组的所述内源性免疫球蛋白区的一部分，其中所述基因组中的这样的缺失保留第二组位点特异性重组位占.c)提供包括侧翼为所述第二组位点特异性重组位点的部分人免疫球蛋白可变区的载体，所述部分人免疫球蛋白可变区具...

【专利技术属性】
技术研发人员：马赛厄斯·瓦布尔，奈杰尔·基林，
申请(专利权)人：特里安尼公司，
类型：
国别省市：