一种提高动物转基因效率的新方法技术

本发明专利技术公开了一种提高动物转基因效率的新方法。本发明专利技术探索了精子和卵母细胞作为载体的转基因方法，通过方法改进，将外源基因分别导入精子和卵母细胞，并通过受精过程使二者携带的外源基因在胚胎中进一步整合，提高了外源基因导入细胞核的效率，而后得到高效率的表达。本发明专利技术在雌雄小鼠进行交配前，分别采用打点注射法转染雌、雄性生殖细胞系，然后挑选出手术后1～5天与35～40天的公鼠，1～7天的雌鼠进行交配，得到转基因小鼠后代。本发明专利技术探索了绵羊的转基因，本发明专利技术所述方法可以提高大型哺乳动物转基因效率，为畜牧业的育种提供了一种新途径。本发明专利技术探索出一种雌雄生殖细胞联合介导的转基因体系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及转基因的方法。具体而言，本专利技术涉及将精子和卵母细胞作为载体的转基因方法，将外源基因分别导入精子和卵母细胞，并通过受精过程使二者携带的外源基因在胚胎中进一步整合，以提高外源基因导入细胞核的效率。
技术介绍
转基因动物是用实验的方法将所需的目的基因导入动物的受精卵内，使其增殖，并能稳定的遗传给后代。目前科学家已成功地获得了转基因鼠、兔、鸡、山羊、猪、绵羊、牛、蛙以及多种转基因鱼。转基因动物是遗传学发展新的里程碑，在基因功能及表达研究、人类疾病模型建立、器官移植材料供应、珍贵医药用蛋白生产以及畜牧业等各方面显示出巨大的优越性和广阔的应用前景[曾溢涛.转基因动物与生物医药产业.生物学通报，1999，34(4)：1-3.王建辰，马保华.转基因技术在畜牧兽医中的发展前景.动物医学进展，2000，21(1)：1-8.]。转基因技术发展近三十年来，人们探索出了多种方法。现在人们对转基因方法的要求日益提高，除了要求效率高，操作简单，更希望导入方法安全可靠，最好能按照人们的意愿导入或改造多个基因。精子载体法在经过倍受争议的10多年后，已经被研究人员证实，这是一种比较简单有效的转基因方法。同时，卵母细胞作为遗传物质最重要的载体，从一开始就得到大家的广泛关注。精原干细胞具有自增殖能力，可产生不断更新的干细胞及可定向分化的精原细胞，每次分裂形成的两个细胞，一个通过初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞等过程发育为精子；一个仍为精原干细胞，保持原始未分化状态和继续分裂增殖的能力，因此转染精原干细胞后，该动物能比较持续的产生转染精子。由于这一优越性，精原干细胞的转染也倍受关注。Kuznetsov等[KuznetsovA.V.，Kuznetsova I.V.，Schit IY.DNA interaction with rabbit sperm cellsand its transfer into ova in vitro and in vivo.Mol Reprod Dev，2000，56：292-297.]在实验中结合了慢病毒和精原干细胞介导法转染小鼠，得到40％的转基因小鼠，6％的小鼠能将外源基因遗传给后代。精子载体法作为一种转基因的方法，操作简单，转基因效率高，无需特殊的仪器。效果比较突出的有单精注射法(ICSI)和精子介导的体内转染法。由于精子载体法使用的质粒多线性化，这就使得这种环状基因结构被破坏的几率很高，加之导入的外源基因是随机整合，故极易引起外源基因功能结构的破坏或失活，从而直接影响或抑制其表达[郭志勤.家畜胚胎工程.1998，中国科学技术出版社.]。有研究表明，绝大多数种类的动物精子有自发结合外源DNA的能力，其结合率从15％到80％不等[Lavitrano M.，Busnelli M.，Cerrito M.G.，et al.Sperm-mediated gene transfer.Reprod Fertil Dev，2006，18(1-2)：19-23.]。Spadafora[Spadafora C.Sperm cells and foreign DNA：a controversialrelation.Bioessays，1998，20：955-964.]提出了外源DNA内化的假想模型：正常射出的精子，顶体后躯膜上的DNA结合蛋白(DBP)结合外源DNA的能力被IF-1因子抑制，当精子充分洗涤或采用无精浆的精液后，IF-1的抑制作-->用被解除，外源DNA与DBP相互作用形成DNA-DBP复合体，DNA-DBP复合体结合到CD4上，并组装成DNA-DBP-CD4复合体。该复合体内化通过核孔到达核基质，在核基质区外源DNA被解离并与精子的染色体DNA紧密接触。游离的蛋白复合体循环到膜上再转运新的DNA分子。外源DNA在精子基因组中的整合区域多发生在核基质区或拓扑异构酶II的识别序列附近；而整合的时间多发生在受精的前后，受精卵雌雄原核的染色体DNA上有单链断裂缺口，早期胚胎细胞活跃分裂增殖过程中，DNA复制过程中留下了大量复制叉与复制片段，这些单链缺口为外源DNA整合到基因组中提供了前提和保证。另外，外源DNA在进入宿主细胞过程中，激活了核酶系统及DNA修复系统。核酶在降解外源DNA的同时也在自身染色体DNA上产生缺口，在DNA修复系统的作用下，外源DNA得以整合到基因组DNA中。外源DNA在宿主基因组中的整合因发生的时期不同产生的后代类型不同。如果外源DNA在受精卵原核期或胚胎的I细胞期整合到宿主基因组中，得到的是转基因动物，而胚胎II细胞期之后再整合得到的动物就是嵌合体，而那些未能整合到基因组中的外源DNA在胚胎细胞中就会被核酶逐步降解[Chan A.W.，Luetjens C.M.，Schatten G.P.Sperm-mediated gene transfer.Curr Top DevBiol，2000，50：89-102.]。目前应用精子为载体介导基因转移获得转基因动物主要通过以下途径来实现：体外精子转染法和体内精子转染法。体外精子转染法又可以分为精子与外源DNA直接共孵育法、体外电穿孔导入法和脂质体介导转染法等；体内精子转染法又可以分为睾丸内注射法、输精管注射法、曲细精管注射法。睾丸注射法就是将外源DNA直接注射到雄性动物睾丸内，转染各个发生阶段的精子细胞，转染精子经体内成熟后采用自然交配或人工授精获得转基因动物。睾丸打点注射法是由Soto等[Sato M.，Iwase R.，Kasai K.，et al.Direct injection offoreign DNA into mouse testis as a possible alternative of sperm-mediatedgene transfer.Anim Biotech，1994，5(1)：19-31.]于1994年率先使用。像猪等动物的曲细精管被厚而不透明的白膜所包围，无法准确把脂质体/DNA复合物注射进入曲精细管，所以选择进行睾丸注射，这样外源DNA能有效地整合进入雄性生殖细胞。1999年，Farre等[Farre L.，Rigau T.，Mogas T.，et al.Adenovirus-mediated introduct ion of DNA into pig sperm and offspring.Mol Reprod Dev，1999，53(2)：149-158.]对猪睾丸内转染，得到47％的精子转染阳性和22％的猪胚胎表达阳性率，同年Sato等[Sato M.Testis-mediatedgene transfer(TMGT)in mice：successful transmission of introduced DNAfrom F0 to F2 generations.Transgenics，1999，3：11-22.]通过睾丸内注射获得了转基因小鼠。Giuili[42]等通过该法使外源基因在精子中稳定的高表达。肖红卫等[肖红卫，郑新民，陈思怀等.精子介导生产转hCD59基因猪.华中农业大学学报，2006，25(2)：170-173.]为研究精子介导法生产异种器官移植用转基因猪的效率，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种提高动物转基因效率的新方法，包括下述步骤：１）制备带有外源基因的质粒；２）将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入雄性动物睾丸组织；３）将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入雌性动物卵巢组织；４）将睾丸注射的雄性动物与雌性动物交配，得到转基因动物后代。

【技术特征摘要】
1.一种提高动物转基因效率的新方法，包括下述步骤：1)制备带有外源基因的质粒；2)将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入雄性动物睾丸组织；3)将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入雌性动物卵巢组织；4)将睾丸注射的雄性动物与雌性动物交配，得到转基因动物后代。2.根据权利要求1所述的一种提高动物转基因效率的方法，其特征在于，所述的打点注射法是直接将外源基因注射到动物睾丸与卵巢组织。3.根据权利要求1所述的一种提高动物转基因效率的方法，其特征在于，所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗向阳，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11