本发明专利技术描述了具有人（或人源化）免疫球蛋白基因座和编码人（或人源化）Ｉｇα和／或Ｉｇβ序列的转基因的转基因动物。尤其是具有转基因重链和轻链免疫球蛋白基因座的能够产生多样化的人（或人源化）抗体谱的动物，其Ｉｇ和／或内源性Ｉｇα和／或Ｉｇβ序列的内源性生产受到抑制。同时表达人（或人源化）免疫球蛋白和人（或人源化）Ｉｇα和／或Ｉｇβ使得正常Ｂ细胞发育、人（或人源化）抗体亲和力成熟以及高效表达。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人或人源化免疫球蛋白在非人转基因动物中增强的表达 专利
本专利技术涉及通过促进正常B细胞发育和通过维持携带有人(或人源化) 免疫球蛋白基因座的非人动物中人(或人源化)抗体的表达而改善非人转基因动物中人(或人源化)免疫球蛋白的表达的方法。特 别地，本专利技术涉及同时表达编码人(或人源化)Ig a和/或Ig P ( B细胞受 体的组分)的转基因以及编码人(或人源化)免疫球蛋白基因座的转基因。 本方法允许人(或人源化)抗体例如在转基因非人动物的血液、乳液或卵 中的显著表达。相关技术的说明抗体是已经成功用于治疗多种人类疾病和病症(例如癌症、过敏性疾 病)、预防移植排斥和宿主抗移植物疾病的一类重要的药学产品。获得自非人动物的抗体制剂的主要问题在于非人免疫球蛋白在人类患者中的固有免疫原性。为了降低非人抗体的免疫原性，已表明可以通过将 动物可变区(V)外显子与人类恒定区(C)外显子融合而获得嵌合抗体基 因。该嵌合或人源化的抗体具有对人类最小的免疫原性并且适合用于人类 受试者的治疗性治疗。已经研发了人源化单克隆抗体并且将其用于临床应用。然而，总体上， 无论是嵌合、人源化还是人单克隆抗体在治疗诸如癌症或烈性病原体感染 等破坏性疾病上的应用由于这些疾病的复杂性、多因子病因学和适应性而 受到限制。针对于单一限定靶标的单克隆抗体通常在这些靶标改变、进化 和突变时失效。例如，恶性肿瘤可获得对标准单克隆抗体治疗的抗性。这 一问题的解决方案是4吏用具有靶向多个进化靶标能力的多克隆抗体。多克隆抗体可以中和细菌或病毒毒素，并引导免疫应答以杀死和消除病原体。因此，对于大规模生产高效价、高亲和性、人源化多克隆和单克隆抗 体的适合方法存在巨大的临床需求。此外，由于从抗体产量的角度讲偏爱 在如兔、鸡、绵羊和牛等较大型转基因动物中生产抗体，因此也高度需要 表达较大量转基因编码的产物的较大型建立者动物的产生。人源化单克隆抗体通常是这样的人类抗体，其中一些CDR残基，以 及可能一些FR残基由来自非人动物(如啮齿类)的抗体的同功位点残基 所取代。基本上可以按照Winter及其同事的方法(Jones等人，AWr。 321: 522( 1986); Riechmann等人，胸跳332: 323( 1988); Verhoeyen 等人，肠證，239: 1534 ( 1988 ))，通过用非人动物(例如啮齿类)CDR 或CDR序列取代人类单克隆抗体的相应序列而进行人源化。在动物中制造人源化抗体时遇到的一个问题是宿主抗体的内源性生产 高于转基因抗体，而需要抑制该内源性抗体的生产。已经描述了抗体(嵌 合和种系突变鼠中的重链连接区(JH)基因)的纯*失，导致内源性抗 体生产的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到该种系突变鼠中 将导致在抗原攻击时人抗体的生产。参见例如，Jakobovits7Vt/W, 90: 2551( 1993 ); Jakobovits等人，7V ， 362: 255( 1993 ); Bruggemann等人，/ /附附w朋/.， 7; 33 ( 1993 ); 2006年6月20日 授权的美国专利No. 7,064,244;其公开内容在此通过整体引用作为参考。将人免疫球蛋白基因导入小鼠基因组导致这些遗传改造的小鼠中多样 4乜的人抗体i普的表达。Pluschke等人，/owfwa, o/ /m附MW0/ogica/ M^/^^ 215: 27-37( 1998 )已经描述了表i^A-鼠嵌合抗体的小鼠的产生。Neuberger 等人，7V,/r 338: 350-2 ( 1989); Lonberg等人，7w/L Wev. /附附wzi0/. 13 (1 ) :65-93 ( 1995 );和Bruggemann等人，C匿0—. 5/他由o/. ，8(4): 455-8 ( 1997); 1996年8月授权的美国专利No. 5,545,806; 1996年8月授 权的美国专利No. 5,545,807和1996年10月授权的美国专利No. 5,569,825 中已经描述了表ii^免疫球蛋白多肽的小鼠的产生，其公开内容在此通过 整体引用作为参考。Kuroiwa等人，A^MM祝We(^ 20(9): 889-894(2002)已经描述了表达人抗体的牛的产生。PCT公开号No. WO 92/03918、 WO 02/12437,以及美国专利No. 5,814,318和5,570,429也已经描述了表ii^(或 人源化)免疫球蛋白转基因座(transloci)的非人转基因动物的生产以及 从该转基因动物生产抗体，其公开内容在此明确地通过整体引用作为参考。 所获得的人源化抗体具有对人最小的免疫原性并且适合用于人类受试者的 治疗性治疗。尽管上面引述的遗传改造方法导致人免疫球蛋白多肽在遗传改造小鼠 中表达，但是人免疫球蛋白的表达水平低于正常水平。这可能由于在免疫 球蛋白基因座中免疫球蛋白的有效表达所需的物种特异性调控元件。如在 转染的细胞系中所显示的人免疫球蛋白基因中存在的调控元件在非人动物 中可能不能适当地发挥作用。已经描述了若干免疫球蛋白基因中的调控元 件。尤其重要的是重链恒定区下游(3')的增强子和轻链基因内部(intronic) 的增强子。此外，其它(仍待鉴定的)控制元件可能存在于免疫球蛋白基 因中。在小鼠中的研究显示了膜结合形式的免疫球蛋白分子的膜和胞质尾部分对于人Cyl基因为纯合的小鼠血清中人-鼠嵌合抗体的表达水平起重 要作用。因此，对于动物中异源性免疫球蛋白基因的表达，需要用通常在 动物的类似位置中发现的序列来代替含有增强子元件和编码跨膜部分的外 显子(Ml外显子)和胞质尾的外显子(M2外显子)的序列。这些遗传改造的动物中的人免疫球蛋白表达也可受到携带人或人源化 免疫球蛋白基因座的非人的B细胞发育的影响。已经在小鼠中广泛地研究 了 B细胞受体(BCR)对B细胞发育的影响。然而，还并不清楚人或部分 人抗体如何组合以形成功能性BCR，以及是否该BCR将有效地影响表达 人(或人源化)Ig的非人B细胞在转基因动物中的发育和存活，其反过来 将影响抗体的产量。附图筒述附图说明图1示出人Ig ot多肽序列(SEQ ID NO: 1 )与其它非人Ig a序列(SEQ II) NO: 2-6)的氨基酸比对。图2示出人Ig P多肽序列(SEQ ID NO: 7 )与其它非人Ig p序列(SEQ ID NO: 8-12)的氨基酸比对。专利技术概述一方面，本专利技术提供编码BCR的嵌合Igoc亚基的转基因构建体，其 中该嵌合Ig ot亚基包括非人Ig a多肽序列的细胞内结构域序列和跨膜结构 域序列；以及与SEQIDNO.: 1的人Ig ct的胞外结构域具有至少85%序 列同一性的多肽。第二方面，本专利技术提供编码BCR的嵌合Ig P亚基的转基因构建体， 其中该嵌合Ig P亚基包括非人Ig P多肽序列的细胞内结构域序列和跨膜结 构域序列；以及与SEQ ID NO.: 7的人Ig (3的胞外结构域具有至少85% 序列同一性的多肽。本专利技术的某实施方式中，非人Iga多肽序列的类型包括但不限于牛 (SEQ ID NO: 2);鼠(SEQ ID NO: 3);犬(SEQ I本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码ＢＣＲ的嵌合Ｉｇα亚基的转基因构建体，所述嵌合Ｉｇα亚基包括： （ａ）非人Ｉｇα多肽序列的胞内结构域序列和跨膜结构域序列；以及 （ｂ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１的人Ｉｇα的胞外结构域具有至少８５％序列同一性的多肽。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-9-1 60/841,8901. 一种编码BCR的嵌合Igα亚基的转基因构建体，所述嵌合Igα亚基包括(a)非人Igα多肽序列的胞内结构域序列和跨膜结构域序列；以及(b)与SEQ ID NO.1的人Igα的胞外结构域具有至少85％序列同一性的多肽。2. —种编码BCR的嵌合IgP亚基的转基因构建体，所述嵌合IgP亚 基包括(a) 非人IgP亚基的胞内结构域序列和跨膜结构域序列；以及(b) 与SEQ ID NO.: 7的人Ig P的胞外结构域具有至少85%序列同 一性的多肽。3. 权利要求1的转基因构建体，其中所述非人Igot多肽序列包括牛 (SEQ ID NO: 2 );鼠类(SEQ ID NO: 3 );犬(SEQ ID NO: 4 );灵长类(SEQIDNO: 5);兔(SEQIDNO: 6)或其它非人序列。4. 权利要求2的转基因构建体，其中所述非人IgP多肽序列包括犬 (SEQIDNO: 8);大鼠(SEQIDNO: 9);牛(SEQIDNO: 10);鼠类(SEQIDNO: 11);鸡(SEQIDNO: 12)或其它非人序列。5. —种非人转基因动物，包括(a )编码SEQ ID NO.: 1的全长人Ig a亚基，或权利要求1的嵌合 Iga亚基的转基因构建体；和/或(b) 编码SEQ ID NO.: 7的全长人Ig P亚基，或权利要求2的嵌合 IgP亚基的转基因构建体；和(c) 编码人或人源化免疫球蛋白基因座的转基因构建体； 其中生成的转基因产物组合以形成人或人源化B细胞受体复合物。6. 权利要求5的非人转基因动物，其中充分地降低非人转基因动物的 任何内源性Ig产物和/或Ig a和/或Ig P亚基的表达。7. 权利要求5的非人转基因动物，其中所述动物选自兔、小鼠、大鼠、猪、绵羊、山羊、鸟类、马、驴和牛。8. 权利要求5的非人转基因动物，其是兔。9. 来自权利要求5的非人转基因动物的分离的人或人源化免疫球蛋 白，其中所述人或人源化免疫球蛋白是抗体或抗体片段。10. 权利要求9的分离的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗体是多 克隆或单克隆抗体。11. 权利要求9的分离的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗体片段 是多克隆抗体或单克隆抗体的片段。12. 权利要求9的分离的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗体或抗 体片段^皮标记。13. 权利要求9的分离的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗体或抗 体片段与毒素融合以形成免疫毒素，或者与治疗剂偶联。14. 权利要求9的分离的人或人源化免...
【专利技术属性】
技术研发人员：R比洛，
申请(专利权)人：人类多细胞株治疗学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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