本发明专利技术涉及一种转基因鱼类细胞及其应用，即能用于遗传毒性检测的转基因牙鲆鳃细胞p21FGLuc和用该转化体作为生物指示物的应用。本发明专利技术所设计的遗传毒性检测系统，操作简便快速，具有合适的专一性和灵敏度，可快速和高通量筛选药品和环境污染物的遗传毒性，这对于保护人类的生命健康和生物种的正常延续具有重要而深远的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物指示物
，具体涉及一种转基因鱼类细胞及其应用。
技术介绍
环境中的遗传毒物能直接或间接地损伤生物体的DNA，使基因和染色体发生突变而诱发肿瘤，甚至通过生殖细胞将这种损伤传递给后代，危害人类健康和动植物的生存。因此，建立快速有效的遗传毒性检测技术和评价体系具有重大意义。目前的遗传毒性的检测终点可分为4大类基因突变、DNA损伤、染色体损伤和染色体组损伤。虽然目前已建立的遗传毒性检测技术有200多种，但真正经过验证有合适的灵敏度和特异性的检测方法只有十几种。而且由于一种遗传毒性检测方法通常只能反映一个或两个遗传学终点，不能涵盖所有的遗传学终点，故要对某种药品的遗传毒性做出准确评价，往往需要进行多个遗传毒性检测实验。我国常用的方法有微生物回复突变实验(如Ames实验)、哺乳动物培养细胞染色体畸变实验、啮齿动物微核实验和体外真核细胞基因突变实验等。如体内诱变实验显示I个或以上阳性结果，则还需要进行生殖细胞遗传毒性测试。细菌Ames实验是检测基因突变的常用方法，快速简便，特异性高，但灵敏性偏低，不能检测与真核细胞结构相关的遗传毒性效果，代表性差。微核实验和染色体畸变实验涉及到染色体的制备，实验操作难度大，比较慢。酵母和哺乳动物细胞基因突变实验也存在灵敏度低的问题。彗星实验用于检测DNA损伤快速灵敏，但假阳性率高。活体动物实验如转LacZ基因小鼠突变实验，成本高，实验难度大，只有少数实验室有能力做。随后，为实现遗传毒性检测的快速和高通量，人们又发展出报告基因检测系统，即将绿色荧光蛋白基因(GFP)和荧光素酶基因(Iuc)与DNA损伤反应相关基因的启动子相连接，通过检测荧光信号的变化来检测细胞内的DNA损伤。RAD54基因是酵母细胞中的DNA损伤修复基因，目前已有多种以RAD54基因启动子驱动的GFP或Iuc报告基因遗传毒性检测系统在酵母中建立起来，并且具有较高的特异性和灵敏性，也适于高通量筛选(ffalmsley et al.,1997. Yeast 13,1535-1545 ;Billinton et al.,1998.Biosensors &Bioelectronics 13，831-838 ;Liu et al.,2008.Mutation Research 653,63-69)。在哺乳动物细胞中存在p53信号转导通路，当细胞暴露于具有遗传毒性的化学物质而出现DNA损伤时，p53信号通路可以感受这种损伤信号，上调细胞内p53蛋白的水平。P53是一种重要的转录因子，能够识别并激活其下游一系列靶基因的表达，例如DNA修复基因P53R2、生长停滞和DNA修复基因GADD45a和细胞周期抑制因子p21基因等，引起细胞生长停滞，进行DNA修复，如果损伤太严重而无法修复的话，则启动细胞凋亡。因此，p53又是一种肿瘤抑制因子，并被称为“基因组卫士”，在维持基因组的稳定上起重要作用。总之，将这些基因的启动子与报告基因相连，并整合到哺乳动物细胞基因组中，得到的转基因细胞就可以用于药品或环境样品的遗传毒性检测。Ohno等(2005，2006)将由P53R2基因启动子驱动的荧光素酶重构基因(P53R2-1UC)导入人的培养细胞(p53+)中，构建了人转基因细胞遗传毒性检测系统(Ohno et al. , 2005. Mutation Research 588,47-57 ;0hno et al.，2008. Mutation Research 656，27-35)。用各种遗传毒物和非遗传毒物处理该细胞，然后检测荧光素酶基因的表达，发现该系统操作简便，具有很好的专ー性和灵敏性。Hastwell等(2006,2009)将GADD45a基因启动子驱动的GFP重构基因(GADD45a_GFP)导入人的TK6细胞(P53+)中，发现所构建的人转基因细胞遗传毒性检测系统具有较高的专ー性和灵敏性(Hastwell et al.,2006. Mutation Research 607,160-175 ;Hastwell et al.,2009.Mutagenesis24(5) ,455-463)。最近，Zager 等(2010)又将 p21 基因启动子驱动的 GFP 重构基因(P21-GFP)导入人肝癌细胞H印G2(p53+)中，成功构建了哺乳动物细胞遗传毒性检测系统，该系统建立在DNA损伤介导的p21基因的表达基础上，快速简便，具有较高的专ー性和灵敏性(Zager et al. , 2010. Radiol. Oncol. 44 (I), 42-51)。但是，这些已建立的基于p53信号通路对DNA损伤反应基础上的哺乳动物细胞遗传毒性检测系统，还存在以下几个问题(I)哺乳动物细胞系大多来源于肿瘤组织，而50%以上的肿瘤组织细胞中的P53基因或p53通路相关基因发生了突变，因此可利用的哺乳动 物细胞并不多。(2)哺乳动物细胞对培养条件的要求高，培养温度需要恒定在37°C，需要专门的培养设备CO2培养箱，这制约了这些遗传毒性感受细胞的运输和商品化。(3)肿瘤细胞生长快，需要每隔3-5天更换培养基，使这些遗传毒性感受细胞商品化后的保质期难以令人满意。⑷细胞中GFP的表达量要足够高，荧光信号的強度才能达到检测要求。因此，GFP报告基因检测系统需要设定阈值，相对荧光信号(即遗传毒物处理组GFP荧光强度/未处理组GFP荧光强度)需要大于此阈值才能认定为阳性結果。(5)处理组与对照组之间的细胞接种密度差异和取样误差等可显著影响检测結果。因此，有必要建立ー种非哺乳动物的细胞遗传毒性检测系统。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供ー种转基因鱼类细胞及其应用，即能用于遗传毒性检测的转基因牙鲆鳃细胞p21FGLuc，从而弥补现有技术的不足。本专利技术将含有萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)报告基因的质粒和含有海肾荧光素酶基因(Renilla luciferase)的质粒转入到牙鲆鳃细胞中建立了转基因牙鲆鳃细胞p21FGLuc，该转化细胞可以有效地对环境中的有毒物质进行指示，从而促成了本专利技术。本专利技术的ー个方面涉及ー个转基因牙鲆鳃细胞p21FGLuc，其保藏编号为CCTCC C201251，保藏单位中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，保藏日期2012年4月25日。该转基因牙鲆鳃细胞携带有表达萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)报告基因的质粒pGL3-p21-Iuc (萤火虫荧光素酶由人p21基因启动子驱动)和含有表达海肾荧光素酶基因(Renilla luciferase)的质粒pRL-CMV_luc (海肾荧光素酶由细胞肥大病毒启动子CMV驱动)。本专利技术的另ー个方面涉及到转基因牙鲆鳃细胞的应用，用于指示环境样品或化学药品的遗传毒性。本专利技术还涉及ー个遗传毒性检测系统，该系统用转基因牙鲆鳃细胞作为生物指示物。该遗传毒性检测系统的使用方法如下以不同浓度的环境样品或化学药品处理转基因细胞；24小时后，收集处理后的转基因细胞进行裂解；测定各个细胞裂解液样品的萤火虫荧光发光值RLU和海肾荧光发光值RLU，计算每个样品的相对荧光比值萤火虫荧光RLU/海肾荧光RLU ;然后根据该比值本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー个转基因牙鲆鳃细胞，其保藏编号为CCTCC C 201251。2.如权利要求I所述的转基因牙鲆鳃细胞，其特征在于该转基因牙鲆鳃细胞携带有表达萤火虫荧光素酶报告基因的质粒pGL3-p21-luc和含有表达海肾荧光素酶基因的质粒pRL-CMV-luc。3.权利要求I所述的转基因牙鲆鳃细胞的应用，其特征在干，是用于指示环境样品或化学药品的遗传毒性。4.一种遗传毒性检测系统，其特征在于，所述的遗传毒性检测系统是用权利要求I所述的转基因牙鲆鳃细胞作为生物指示物。5.权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭华荣，耿德玉，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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