一种基于RPA CRISPR Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的试剂盒及方法，属于鱼类病理分子诊断技术领域。所述试剂盒，包括crRNA、RPA引物、逆转录酶、Cas12a蛋白、ssDNA探针；所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述检测方法基于重组酶聚合酶扩增结合CRISPR‑Cas12a技术。本发明专利技术通过RPA扩增及Cas12a识别可双重特异的对牙鲆弹状病毒进行检测，特异性强，灵敏度可低至8.7拷贝/ul，远高于常规PCR，可以在感染潜伏期检测出牙鲆弹状病毒，从而对牙鲆弹状病毒病进行防治。本发明专利技术具有可视化，操作简单的优点，可直接通过肉眼观察试纸条显色结果来判定检测结果，特别适合于在水产现场推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于鱼类病理分子诊断，尤其涉及一种基于rpa-crispr-cas12a体系构建的牙鲆弹状病毒检测试剂盒和检测方法。

技术介绍

1、牙鲆弹状病毒（hirame novirhabdovirus, hirrv）是一种具有囊膜不分段的单股负链rna病毒，可引起牙鲆等多种海淡水鱼类病害的重要病毒性病原。hirrv具有传播性强，病程短，致死率高的特点，是牙鲆养殖过程中最常见的疾病之一，给牙鲆养殖业造成了严重危害，同时也给全球的鱼类养殖业带来了潜在威胁。因此，牙鲆弹状病毒病的快速诊断，可帮助养殖户及时采取相应防控措施，有效控制疾病的暴发和流行，降低养殖风险。

2、准确灵敏的分子生物学诊断技术对于hirrv病的早期诊断具有重要意义，对及时遏制该病的暴发与流行至关重要。目前，已报道的hirrv分子检测方法主要包括一步逆转录聚合酶链式反应（rt-pcr）、巢式rt-pcr及rt-qpcr等。但这些方法仍需依赖pcr仪、荧光定量pcr仪等设备，实验操作繁琐、耗时较长，且结果判定不够直观，因此不便在水产现场推广应用。针对病原蛋白的胶体金检测技术虽然可以实现本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种检测牙鲆弹状病毒的crRNA，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。

2.一种检测牙鲆弹状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的crRNA。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括RPA引物，所述RPA引物为Primer-F-RPA和Primer-R-RPA；所述Primer-F-RPA核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述Primer-R-RPA核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，还包括逆转录酶、Cas12a蛋白、ssDNA探针。

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【技术特征摘要】

1.一种检测牙鲆弹状病毒的crrna，其特征在于，所述crrna的核苷酸序列如seq idno. 1所示。

2.一种检测牙鲆弹状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的crrna。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括rpa引物，所述rpa引物为primer-f-rpa和primer-r-rpa；所述primer-f-rpa核苷酸序列如seq id no.6所示，所述primer-r-rpa核苷酸序列如seq id no.9所示。

4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，还包括逆转录酶、cas12a蛋白、ssdna探针。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述ssdna探针的核苷酸序列为fam-tttttttattttttt-biotin。

6.一种基于rpa-crispr-cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取待测样品基因组rna；（2）以步骤（1）中的基因组rna为模板，利用权利要求3中所述rpa引物进行等温扩增反应，得到rpa扩增产物；（3）利用步骤（2）获取的rpa扩增产物，以及cas12a蛋白、ssdna探针、权利要求1所述的crrna分子在crispr-cas12a反应体系里反应，获得反应体系溶液；（4）对步骤（3）的反应体系溶液进行试纸条的检测，当试纸条t线显色，则表示待测样品hirrv病毒阳性，当试纸条只有c线显色，则表示待测样品hirrv病毒阴性。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述提取待测样品基因组rna包括如下步骤：1、取2mm左右的牙鲆脾脏组织块用小型研磨器研磨，然后向研磨的组织中加200μl无酶dep...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐小千，王洪升，战文斌，邢婧，绳秀珍，迟恒，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：