一种鱼皮胶原蛋白的制备方法技术

本发明专利技术属于鱼皮胶原蛋白加工领域，具体涉及一种可以作为鱼类细胞培养载体的鱼皮胶原蛋白制备方法，包括原料处理、提取、盐析、纯化透析干燥步骤，其中，所述原料处理中采用无水乙醚于３５～４０℃回流３～４ｈ，除去鱼皮的脂肪，然后风干，得到除脂后的鱼皮渣；所述提取步骤为：按照固液比为１∶５０～７０，将０．５～０．６Ｍ乙酸加入除脂后的鱼皮渣中，浸提６０～８０ｈ，４０目筛卷网过滤得到含鱼皮胶原蛋白的滤液；重复进行一次。本发明专利技术在保持所得鱼皮胶原蛋白的生物特性、纯度的基础上，提高得率，并且应用所得鱼皮胶原蛋白作为鱼类细胞培养载体时，细胞亲和性好、贴壁速度快、细胞生长良好、生长密度高，相对于牛皮胶原蛋白或鼠尾胶原蛋白而言取得了显著的进步。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于鱼皮胶原蛋白加工领域，具体涉及一种可以作为鱼类细胞培养载体的 鱼皮胶原蛋白制备方法。
技术介绍
胶原蛋白是一种重要的功能性蛋白质，胶原蛋白含有一种独特的氨基酸-羟脯氨 酸(Hyp)，胶原蛋白与细胞增生、分化、运动、免疫、关节润滑、伤口愈合等密切相关。由于胶 原蛋白的特殊功能，已被广泛应用于医药、食品、日用化工、生物合成等工业领域，如医用胶 囊、外科手术材料、食用明胶、照相明胶、化妆品等。目前生产的胶原蛋白的原料主要是猪、牛等陆生哺乳动物的皮、骨和肌腱，因近年 来随着导致疯牛病、口蹄疫等流行病的发生，使得从陆生动物皮、骨中提取胶原蛋白的危险 性增大。欧、美、日本等国家相继出台了不少法规，限制从牛等哺乳动物皮、骨中提取物用于 食品、医药等对人体直接影响的产品中。因而，从水生动物鱼皮中提取安全、卫生、无害的胶 原蛋白已成为当前国内外研发的一个热门课题。我国养殖鱼类产量多年来一直位居世界第 一，同时，随着罗非鱼、斑点叉尾鮰鱼片加工业的发展，具有大量的鱼皮资源，从这些废弃物 中提取胶原蛋白并加以多用途利用，具有较大的开发前景。动物细胞培养需要胶原蛋白作为支持载体，常规的胶原蛋白主要为牛皮胶原和鼠 尾胶原I型胶原蛋白，主要是为了可改善培养瓶、或培养板表面性状，有利于细胞贴壁生 长。在我们的实验中发现，使用牛皮胶原蛋白或鼠尾胶原蛋白作为支持载体，用于草鱼肠道 原代上皮细胞、肝脏原代细胞培养时细胞贴壁速度慢，细胞生长不是很理想。现有技术中，利用鱼皮提取胶原蛋白的方法有以下几种1、专利号为02111683. 0的中国专利技术专利公开了一种以深海鱼皮为原料的生物相 容性好的胶原蛋白及其制备方法通过碱溶液处理鱼皮，再利用限制性酶解方法处理上述 鱼皮，净化酶解上清液即得可降解生物相容性的鱼皮胶原蛋白；该技术方案中，碱性条件容 易造成肽键水解，不易获得完整的大分子胶原蛋白，而且酶的使用使得成本提高，并且，该 技术方案中胶原蛋白的得率也不高，为5% 8%质量百分数，得率不高。2、专利号为200710024384.0的中国专利技术专利公开了一种淡水鱼皮胶原蛋白的 制备方法，属于水产加工
将鱼皮洗净、浙干、剪碎后；首先用含有0. 005% -2% (V/V)双氧水的0. 001-0. 2M的碱液浸泡3-48H ；高速搅拌后，再用有机试剂清洗、浸泡； 然后用含有0.01%-2% (M/V)胃蛋白酶的PH在1.0-5.0的酸液提取12-64H，所得体 系用30-10CMM的膜过滤后，再用1-3CMM的膜过滤；最后向滤液中加入5M NaCl溶液至 0. 8-2. 0M，离心所得沉淀用0. 001-0. IM乙酸溶解，蒸馏水透析，冷冻干燥，即可得到洁白无 腥味的胶原蛋白固体；该技术方案中，酶的使用使得成本提高。3、专利号为200510047408. 5的中国专利技术专利公开了一种酸溶性鱼皮胶原蛋白， 包括原料处理、提取、盐析、纯化透析干燥步骤，具体包括(1)原料处理海鱼皮为原料，切碎；(2)提取=NaCl溶液浸泡去杂质、乙醇丙酮脱脂的处理，进而用柠檬酸和醋酸的混 合液浸泡提取后离心分离得酸溶性鱼皮胶原溶液；(3)盐析再经NaCl固体盐析得酸溶性鱼皮胶原蛋白沉淀；(4)纯化透析干燥最后将酸溶性鱼皮胶原蛋白沉淀溶解于醋酸溶液中，而后在 Na2HPO4 (pH8. 6)中透析，或经分子量大于6万的醋酸纤维中空纤维膜进行超滤处理，透析或 超滤得到的固体真空冷冻干燥即可得到产品。产品洁白，无腥味，冷冻干燥后呈海绵状。胶 原蛋白制品纯度达>97%。胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸，其水解产物 中还有生理活性肽，胶原蛋白分子量大于60000，含有3条异种α链，S卩α (Ι)、α2(Ι)和 α 3(1)，该方案中胶原蛋白的得率为12% 14%质量百分数，得率不高。4、专利号为200610036860. 6的中国专利技术公开了一种提取胶原的方法及用胶原制 备胶原蛋白的方法，以罗非鱼皮为原料，将鱼皮剪碎后加入正己烷，脱脂后用0. 05 0. 2Μ 的NaOH溶液除杂蛋白，然后用醋酸溶液提取胶原蛋白，经浓缩、冷冻干燥得到胶原。并且，上述4种方案并没有指出所得鱼皮胶原蛋白作为鱼类细胞培养载体具有意 想不到的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，在保持所得鱼皮胶原蛋白的 生物特性、纯度的基础上，提高得率，并且应用所得鱼皮胶原蛋白作为鱼类细胞培养载体。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为，包 括原料处理、提取、盐析、纯化透析干燥步骤，其中，所述原料处理、提取步骤具体包括(1)原料处理清除鱼鳞，将鱼皮剪成碎粒，按照固液比为1 15 25，将氢氧化 钠(NaOH)水溶液加入鱼皮碎粒，1 5°C下浸泡3 5h，用20目筛卷网过滤得鱼皮滤渣，风 干；以鱼皮滤渣的体积份为1份，用3 5份的无水乙醚于35 40°C回流3 4h，除去鱼 皮的脂肪，然后风干，得到除脂后的鱼皮渣；其中，所述鱼皮碎粒的尺寸约为2mmX2mmX2mm ；所述氢氧化钠水溶液的浓度为 0. 04M 0. 05M ；(2)提取按照固液比为1 50 70，将0.5 0.6M乙酸加入除脂后的鱼皮渣 中，浸提60 80h，40目筛卷网过滤得到含鱼皮胶原蛋白的滤液；重复进行一次。上述技术方案中，所述原料选自草鱼、斑点叉尾鮰或罗非鱼的鱼皮，鱼皮可以是 干燥的也可以是新鲜的。上述技术方案中，所述盐析步骤为经终浓度为2. 5M氯化钠(NaCl)盐析得到胶原 蛋白沉淀。上述技术方案中，所述纯化透析干燥步骤为将步骤(3)所得胶原蛋白沉淀溶解 于0. 5M乙酸，然后先以0. 5M乙酸为透析外液进行透析3 5次、再以双蒸水作为透析外液 进行透析，直至透析外液检测不到氯离子，以保留分子量IOOkDa以上的胶原蛋白；收集透 析后的胶原蛋白液体，采用冷冻干燥方法进行干燥，得到鱼皮胶原蛋白。本专利技术同时要求保护采用上述技术方案得到的鱼皮胶原蛋白，所述鱼皮胶原蛋白 的羟脯氨酸含量为8. 2 8. 5%质量百分数，胶原蛋白纯度平均值为89. 92 94. 62% ；所 述鱼皮胶原蛋白含有3种I型胶原蛋白，S卩116KDa的α UlOOKDa的α 2肽链以及200KDa的β链。采用上述鱼皮胶原蛋白作为鱼类细胞培养的支持载体时，细胞亲和性好、贴壁速 度快、细胞生长良好、生长密度高，相对于牛皮胶原蛋白或鼠尾胶原蛋白而言取得了显著的 进步，因此，本专利技术同时要求保护上述鱼皮胶原蛋白作为鱼类细胞培养的支持载体的应用， 以及应用上述鱼皮胶原蛋白作为鱼类细胞培养的方法，具体包括以下步骤将上述鱼皮胶 原蛋白粉以质量含量0. 13 0. 15%的量溶解于0. IM乙酸中，并均勻铺满细胞培养瓶、或细 胞培养板内表面，作为鱼类细胞培养的支持载体。上述技术方案中，所述鱼类细胞优选自草鱼肠道原代上皮细胞、草鱼肝脏原代细 胞。由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本专利技术具有如下优点1、本专利技术中使用无水乙醚去除脂肪，既便于干燥，又可以提高鱼皮胶原蛋白收 率；2、本专利技术中使用0. 5 0. 6Μ乙酸作为胶原蛋白提取溶剂，可以提高鱼皮胶原蛋白 收率；整个工艺中均使用乙酸作为溶剂，适合于鱼类细胞培养支持载体的需要；3、本专利技术整个制备过程中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼皮胶原蛋白的制备方法，包括原料处理、提取、盐析、纯化透析干燥步骤，其特征在于，所述原料处理、提取步骤具体包括：　　（１）原料处理：清除鱼鳞，将鱼皮剪成碎粒，按照固液比为１∶１５～２５，将氢氧化钠水溶液加入鱼皮碎粒，１～５℃下浸泡３～５ｈ，用２０目筛卷网过滤得鱼皮滤渣，风干；以鱼皮滤渣的体积份为１份，用３～５份的无水乙醚于３５～４０℃回流３～４ｈ，除去鱼皮的脂肪，然后风干，得到除脂后的鱼皮渣；所述氢氧化钠水溶液的浓度为０．０４Ｍ～０．０５Ｍ；　　（２）提取：按照固液比为１∶５０～７０，将０．５～０．６Ｍ乙酸加入除脂后的鱼皮渣中，浸提６０～８０ｈ，４０目筛卷网过滤得到含鱼皮胶原蛋白的滤液；重复进行一次。

【技术特征摘要】
一种鱼皮胶原蛋白的制备方法，包括原料处理、提取、盐析、纯化透析干燥步骤，其特征在于，所述原料处理、提取步骤具体包括(1)原料处理清除鱼鳞，将鱼皮剪成碎粒，按照固液比为1∶15～25，将氢氧化钠水溶液加入鱼皮碎粒，1～5℃下浸泡3～5h，用20目筛卷网过滤得鱼皮滤渣，风干；以鱼皮滤渣的体积份为1份，用3～5份的无水乙醚于35～40℃回流3～4h，除去鱼皮的脂肪，然后风干，得到除脂后的鱼皮渣；所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.04M～0.05M；(2)提取按照固液比为1∶50～70，将0.5～0.6M乙酸加入除脂后的鱼皮渣中，浸提60～80h，40目筛卷网过滤得到含鱼皮胶原蛋白的滤液；重复进行一次。2.根据权利要求1所述鱼皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述原料选自草鱼、 斑点叉尾鮰或罗非鱼的鱼皮。3.根据权利要求1所述鱼皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述盐析步骤为经终 浓度为2. 5M氯化钠盐析得到胶原蛋白沉淀。4.根据权利要求1所述鱼皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化透析干燥步 骤为将步骤(3)所得胶原蛋白沉淀溶解于0. ...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶元土，蔡春芳，戴如燕，唐崭，姚仕彬，宋亮，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]