一种能够表达人抗体的转基因动物的制备方法技术

本发明专利技术涉及能产生人抗体的小鼠的制备方法，该方法包括将携带包含人抗体重链基因座的部分片段的转基因小鼠，与携带插入到小鼠基因组DNA中具有未经重排的人抗体轻链基因座部分片段的小鼠杂交，所述人抗体重链和轻链基因座在转基因小鼠中可以进行基因重排和基因转变，以产生各种人源免疫球蛋白。其中小鼠内源抗体重链基因座、小鼠内源抗体κ轻链基因座和Lamda轻链基因座被失活。

【技术实现步骤摘要】
一种能够表达人抗体的转基因动物的制备方法
本专利技术涉及的是一种产生人抗体的小鼠的制备方法。
技术介绍
由细菌、真菌、病毒和寄生虫导致的感染性疾病的治疗很大程度基于抗生素的治疗。然而，抗药性的出现要求不断开发新的抗生素。患有恶性疾病和癌症的患者的治疗主要基于化疗，然而，这些治疗中的许多是无效的，并且患者的死亡率高，对于感染性疾病和癌症，需要改进和创新的治疗。抗移植器官排斥的甾体类治疗需要使用生物试剂(单克隆或多克隆抗体制剂)，该生物试剂在移植受体中逆转正在进行的同种异体免疫应答。从动物获得的抗体制剂的主要问题是人类患者中非人免疫球蛋白的免疫原性。为了减少非人免疫球蛋白的免疫原性，提出了在动物中对抗体基因进行改构.例如，已经证明通过融合鼠源抗体可变(V)区外显子和人恒定(C)区外显子，可以获得嵌合抗体基因。然而，该方法只能去除由非人Fc区导致的免疫原性，而其余的非人Fab序列仍然可以是免疫原性的。在另一种方法中，将人免疫球蛋白重链和轻链基因导入了小鼠基因组中。已经有几种将人免疫球蛋白基因导入小鼠基因组中使人各种抗体所有组成组件在基因工程化小鼠中的表达的方法。我们提供了一种利用细菌人工染色体载体(BAC)将人免疫球蛋白重链和轻链基因导入了小鼠基因组中的方法。在小鼠血清中可以检测到人抗体的分泌。
技术实现思路
本专利技术提供包含两个人免疫球蛋白基因座部分片段的转基因非人类哺乳动物，其中所述两个人免疫球蛋白基因座中的一个是人重链基因座，而另一个基因座是人轻链基因座的。在某些转基因非人类哺乳动物中，所述人免疫球蛋白基因座包含人类14号和2号染色体的片段，所述人免疫球蛋白重链与轻链基因座随机整合在非人哺乳动物基因组DNA中。在这些转基因非人类哺乳动物中，所述人重链和轻链基因座的被克隆到细菌人工染色体(BAC)载体中，所克隆的人免疫球蛋白重链基因座部分片段包含至少一个非重组过的可变区基因(V)、D区基因(D)、连接区基因(J)和恒定区基因(C)以及重链基因座的3‘-增强子核心序列，所述序列可以在不同的BAC载体中。所克隆的人免疫球蛋白轻链基因座部分片段包含至少一个非重组过的可变区基因(V)、连接区基因(J)和恒定区基因(C)以及轻链基因座的3‘-增强子核心序列，所述序列可以在不同的BAC载体中。在某些转基因非人类哺乳动物中，所述转基因非人类哺乳动物是小鼠。在转基因非人类哺乳动物中，所述内源哺乳动物重链基因座和至少一个哺乳动物轻链基因座被失活。在某些这样的转基因非人类哺乳动物中，所述内源哺乳动物重链基因座(IgH)和K轻链基因座(IgK)和Lamda轻链基因座(IgL)被失活。本专利技术还提供检测转基因非人哺乳动物血清中人抗体表达的方法，所述方法包括：小鼠血清的制备，酶联免疫竞争的方法检测小鼠血清中人抗体IgM的浓度。本专利技术还提供用于产生多种表达人抗体序列的B细胞的方法，所述方法包括：提供包含两个人免疫球蛋白基因座部分序列的转基因非人类哺乳动物，其中所述两个人免疫球蛋白基因座中的一个是人重链基因座，而另一个基因座是人轻链基因座；并且其中所述基因座中至少一个是由BAC载体导入的；并且对所述转基因非人类哺乳动物免疫，可以产生多种表达人抗体序列的B细胞并收集多种表达人抗体表达序列的B细胞。这些方法还包括使所述多种B细胞与骨髓瘤细胞融合形成可以分泌人单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法。其它这样的方法还包括从所述杂交瘤细胞中克隆和纯化所述人抗体序列，所述编码人抗体的序列是全长的。在某些方法中，所述编码人抗体的序列在转染细胞中表达。在某些这样的方法中，所述人轻链基因座包含得自天然人K轻链基因座的未经重排的序列。在某些这样的方法中，所述人K轻链基因座是插入的BAC载体介导的人轻链基因座片段转基因。在某些这样的方法中，所述多种B细胞至少包含编码具有选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中某种抗体类型的B细胞。在某些方法中，所述IgA同种型是IgA1或IgA2。在某些方法中，所述IgG同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些这样的方法中，所述多种B细胞至少包含编码具有选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的不同于所述第一同种型的第二同种型的抗体的第二B细胞。在某些方法中，所述多种B细胞至少包含5种B细胞，每种B细胞编码一种具有不同同种型的抗体，其中所述抗体的类型分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。本专利技术的一种实施方案中，本专利技术提供了改进的BAC转基因构建体或载体，所述转基因构建体或载体含有至少一种人抗体重链和轻链基因座的部分片段，其中该片段或片段的部分经或未经基因修饰而含有至少一种人抗体重链和轻链基因座的片段。这些片段具有在非人动物中进行基因重排和基因突变的能力，从而产生多样的人源免疫球蛋白所有组成成分.本专利技术提供的一种人源Ig基因座是含有一个或多个V基因片段、一个或多个D基因片段、一个或多个J基因片段、以及一个或多个恒定区基因片段的人源化重链基因座，其中至少一个基因片段是人重链基因片段。人源化重链基因座中的基因片段以未重排、部分或完全重排的构型彼此并列。优选的人源化重链基因座含有人恒定区基因片段，优选含Cα或Cγ。更优选的人源化基因座含有多个V基因片段和至少一个人V基因片段，以及一个人重链恒定区片段。人V基因片段位于非人V基因片段下游。另一种人源Ig基因座是含有一个或多个V基因片段、一个或多个J基因片段、以及一个或多个恒定区基因片段的人源化轻链基因座，其中至少一个基因片段是人轻链基因片段。人源化轻链基因座中的基因片段以未重排或重排的构型彼此并列.优选的人源化轻链基因座含有人恒定区基因片段，优选含Cα或Cγ。更优选的人源化轻链基因座进一步含有多个V基因片段和至少一个人V基因片段。人V基因片段位于非人V基因片段下游。甚至更优选的人源化轻链基因座含重排的人VJ片段，置于许多(如10-100)非人或人来源的VL基因片段下游。本专利技术的另一种实施方案涉及通过从非人动物分离Ig基因座或Ig基因座的一部分，并且将需要的人Ig基因片段整合至分离的动物Ig基因座或Ig基因座的分离部分而制备含人源化Ig基因座的转基因载体的方法。通过以保持基因座在非人动物中进行有效基因重排和基因转变的方式进行连接或同源重组，将人Ig基因片段整合至分离的动物Ig基因座或Ig基因座的分离部分。通过同源重组进行的人Ig基因片段的整合可以通过使用本专利技术的重组载体而完成。在另一种实施方案中，本专利技术提供了制备能够产生人源抗体的转基因动物的方法。该转基因动物可以通过将含人源Ig基因座的转基因载体或含人Ig基因片段的重组载体导入受体细胞或动物细胞，并且从基因修饰的受体细胞或细胞得到动物而获得。提供了含一种或多种人源Ig基因座的转基因动物和来源于所述转基因动物的细胞(例如来自于免疫的转基因动物的B细胞).本专利技术的转基因动物可以对转基因的人源Ig基因座进行基因重排和基因转变，以产生多样的人源免疫球蛋白分子所有组成成分。人免疫球蛋白重链基因座位于人14号染色体上，全长1.5mb，有50个左右的可变区基因，D区和J区基因以及9种恒定区(C)区基因组成。用于显微注射的BAC克隆1为人工构建的含6个可变区基因的Ig序列；BAC2和BAC3分别带有原始的和/或人工构建的人抗体重本文档来自技高网...

【技术保护点】
能产生人抗体的小鼠的制备方法，所述小鼠携带转基因，所述转基因已经插入到小鼠基因组DNA中且具有未经重排是人抗体重链和轻链基因座，该方法包括将携带包含人抗体重链基因座的部分片段的转基因小鼠，与携带插入到小鼠基因组DNA中具有未经重排的人抗体轻链基因座部分片段的小鼠杂交，所述人抗体重链和轻链基因座在转基因小鼠中可以进行基因重排和基因转变，以产生各种人源免疫球蛋白。其中小鼠内源抗体重链基因座、小鼠内源抗体κ轻链基因座和Lamda轻链基因座被失活。

【技术特征摘要】
1.一种能产生人抗体的小鼠的制备方法，所述小鼠携带两个人免疫球蛋白基因座部分片段，具体的含有未经重排的人抗体重链和轻链基因座片段，其中未经重排的人抗体重链基因座的部分片段包含至少一个非重组过的可变区基因(V)、D区基因(D)、连接区基因(J)和恒定区基因(C)以及重链基因座的3’-增强子核心序列，未经重排的人抗体轻链基因座片段是人抗体轻链κ基因座片段，包含至少一个非重组过的可变区基因(V)、连接区基因(J)和恒定区基因(C)以及轻链基因座的3’-增强子核心序列；所述未经重排的人...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯东晓，戴洁，张卉，徐从伦，董创创，刘红，
申请(专利权)人：山东国际生物科技园发展有限公司，
类型：发明
国别省市：