利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法技术

本发明专利技术公开了利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法，包括以下步骤：将外接信号肽的B-domain缺失的重组人第八凝血因子cDNA插入质粒载体中形成第八凝血因子的乳腺表达构件，然后通过显微注射或体细胞移植技术获得转基因家兔，获得的转基因家兔的当代或后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第八凝血因子。本发明专利技术实现了第八凝血因子的乳腺表达构件在转基因家兔乳腺生物反应器表达，以制备rhFVIII，转基因家兔进行快速的种群繁殖，可大量分泌含有rhFVIII的乳汁，实现了rhFVIII的批量生产，都在很大程度上降低了生产成本，并且避免了使用血浆中提取的hFVIII感染病毒的风险，提高了用药的安全性。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括以下步骤：将外接信号肽的B-domain缺失的重组人第八凝血因子cDNA插入质粒载体中形成第八凝血因子的乳腺表达构件，然后通过显微注射或体细胞移植技术获得转基因家兔，获得的转基因家兔的当代或后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第八凝血因子。本专利技术实现了第八凝血因子的乳腺表达构件在转基因家兔乳腺生物反应器表达，以制备rhFVIII，转基因家兔进行快速的种群繁殖，可大量分泌含有rhFVIII的乳汁，实现了rhFVIII的批量生产，都在很大程度上降低了生产成本，并且避免了使用血浆中提取的hFVIII感染病毒的风险，提高了用药的安全性。【专利说明】
本专利技术涉及于非人哺乳动物制备重组蛋白药物领域，特别涉及一种。
技术介绍
血友病是人类最常见的一种出血性疾病，具有终身性，反复性和致命性，约每5000-10000个男性中就有一个是血友病患者。血友病是由于血液中某些功能性凝血因子的缺失而造成的，如辅酶凝血因子八(甲型血友病)，以及第九因子(乙型血友病)。由于血友病是由编码循环血浆蛋白的单个X连锁基因缺失引起，因此治疗血友病的重点是合成或提炼具有正常功能的凝血因子代替这种错误蛋白或缺失蛋白。血友病的治疗最初采用全血浆，之后采用从血浆中提取的高度纯化第八因子(hFVIII)浓制剂。患者使用后者治疗，较低剂量可达到较好的疗效。这种疗法虽然可以有效控制出血，但可能会产生其它并发症。血液制品的原料一般来源于捐献者，由于检验技术有限这些血液制品可能携带传染病毒，如B型肝炎病毒和免疫缺陷病毒(HIV)，增加了患者感染病毒的风险。重组人凝血因子(rhFVIII)对凝血因子八缺失或低量分泌所致的遗传性凝血机能缺陷具有纠正作用，专供防治甲型血友病患者的出血症状。仅2005年此药物的全球销售达到十四亿美元。它还可用于治疗创伤性出血、手术性出血、颅内出血以及其他获得性血液疾病，具有强大的市场潜力。有鉴于此，有必要提供一种高效制备重组人凝血因子的方法。
技术实现思路
根据本专利技术的一个方面，提供了一种，包括以下步骤:(I)将`外接信号基因的B-domain(结构域)缺失的重组人第八凝血因子cDNA插入质粒载体中形成第八凝血因子的乳腺表达构件；(2)将乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中，然后将家兔受精卵在FBS B2培养液和35°C~40°C、3%~7% CO2培养箱中培养10-20h，之后将分裂成2~8个细胞的家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因家兔；(3)将乳腺表达构件通过转染至家兔供体细胞中，然后将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因家兔；(4)步骤(2)和步骤(3)获得的转基因家兔的当代或后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第八凝血因子。由此，实现第八凝血因子的乳腺表达构件在转基因家兔乳腺生物反应器表达以制备rhFVIII，转基因家兔进行快速的种群繁殖，可大量分泌含有rhFVIII的乳汁，然后对乳汁进行分离纯化及检测，实现了 rhFVIII的批量生产，都在很大程度上降低了生产成本，并且避免了使用血浆中提取的hFVIII感染病毒的风险，提高了用药的安全性。在一些实施方式中，步骤(1)中,质粒载体为PBC1质粒载体。由此,PBC1质粒载体更佳适用于构建乳腺表达构件。在一些实施方式中，步骤(1)中，乳腺表达构件包括调控元件，调控元件为鸡β球蛋白绝缘子、山羊β_酪蛋白启动子、TATA盒、酪蛋白外显子1、酪蛋白内含子1、β -酪蛋白外显子2、β-酪蛋白外显子7，8，9、β-酪蛋白内含子7，8、β-酪蛋白基因组片段。由此,调控元件实使乳腺表达构件实现在家兔乳腺的基因表达。在一些实施方式中，步骤(1)中，乳腺表达构件包括调控元件，调控元件为鸡β球蛋I白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β -酪蛋白外显子2、β -酪蛋白外显子7，8，9、β -酪蛋白内含子7，8、β -酪蛋白基因组片段、CMV增强子。由此，调控元件实使乳腺表达构件实现在家兔乳腺的基因表达。在一些实施方式中，步骤⑴中，信号基因为bGHployA。由此，bGHployA表达的信号肽起到较好的信号作用。在一些实施方式中，步骤(2)中，乳腺表达构件在显微注射直接注入家兔受精卵之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分；步骤(3)中，乳腺表达构件在转染至家兔细胞之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分。由此，细菌质粒部分的释放避免乳腺表达构件在基因表达时出现干扰杂质。 在一些实施方式中，步骤(3)中，卵母细胞为滤泡卵母细胞或输卵管卵母细胞，家兔供体细胞为胚胎细胞、成纤维细胞和卵丘细胞中的一种。由此，卵母细胞和家兔供体细胞的选择可增加转基因家兔的成活率。在一些实施方式中，步骤(4)中，泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期。由此，泌乳期的增加可提高rhFVIII的产量。在一些实施方式中，步骤(4)中，重组人第八凝血因子为B-domain缺失的重组人第八凝血因子。由此，B-domain缺失的重组人第八凝血因子可实现血友病的辅助治疗及创伤性出血、手术性出血、颅内出血以及其他获得性血液疾病治疗的治疗。【专利附图】【附图说明】图1为B-domain缺失的重组人第八凝血因子rhFVIII cDNA的结构示意图；图2 为 B-deleted rhFVIII cDNA 克隆的测定结果；图3为第八凝血因子的乳腺表达构件pBCl-rhFVIII的基因图谱；图4为pBCl-rhFVIII克隆的测定结果；图5为pBCl-rhFVIII cDNA序列与基因库bank cDNA序列的对比；图6为pBCl-rhFVIII的信号肽和连接肽；图7为pBCl-rhFVIII酶切片段电泳检测结果；图8为第八凝血因子的乳腺表达构件pBCl-CMV-rhFVIII的基因图谱；图9为去除细菌质粒的pBCl-rhFVIII在乳腺上皮细胞MCF-7中的mRNA转录表达;图10为乳腺表达构件注入家兔受精卵时受精卵的状态图；图11为家兔体细胞核移植技术培育转基因家兔的过程。【具体实施方式】下面结合附图对专利技术作进一步详细的说明。实施例1准备B-domain缺失的重组人第八凝血因子cDNA(B_deleted rhFVIIIcDNA)重组人全序列第八凝血因子cDNA (rhFVIII cDNA)，含Al，A2，B，A3，Cl和C2domain,图1 为连接有 bGHployA 的 B-deleted rhFVIII cDNA 的结构示意图，图中 “S，，表示信号基因bGHployA，B-deleted rhFVIII cDNA为人工合成。采用PCR检测方法检测B-deleted rhFVIII cDNA使用的引物为pBClhF8_fs，pBClhF8_Ar，pBClhF8_CF，pBClhF8_r，pBClhF8-fA，图1中箭头所示方向为引物的方向。将B-deleted rhFVIII cDNA 片段感染至 Zero Blunt TOPO 细菌(来源:Inv本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将外接信号基因的B?domain缺失的重组人第八凝血因子cDNA插入质粒载体中形成第八凝血因子的乳腺表达构件；(2)将所述乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中，然后将家兔受精卵在FBS?B2培养液和35℃～40℃、3％～7％CO2培养箱中培养10?20h，之后将分裂成2～8个细胞的家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因家兔；(3)将所述乳腺表达构件通过转染至家兔供体细胞中，然后将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因家兔。(4)步骤(2)和步骤(3)获得的转基因家兔的当代或后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第八凝血因子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛非，杨澜，安礼友，成勇，杜福良，
申请(专利权)人：兰诺生物技术无锡有限公司，
类型：发明
国别省市：