一种山参发根及其培育方法技术

本发明专利技术公开了一种山参发根及其培育方法，以山参根、茎及叶片等为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根，每一个发根即为一个单克隆。经过多次继代培养及反复筛选，逐步建立起山参发根悬浮培养无性系。提供了一种新的山参资源，能够工业集约化生产，不需要占用耕地，不受天气、病虫害等自然界条件的影响，实现了山参有效药用成分生产化室内。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，以山参根、茎及叶片等为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根，每一个发根即为一个单克隆。经过多次继代培养及反复筛选，逐步建立起山参发根悬浮培养无性系。提供了一种新的山参资源，能够工业集约化生产，不需要占用耕地，不受天气、病虫害等自然界条件的影响，实现了山参有效药用成分生产化室内。【专利说明】
本专利技术公开了，开辟了一个山参开发利用的新途径， 为山参发根生产天然药物提供了可能，属于生物
。
技术介绍
发根农杆菌A4具有转移其Ri质粒上的基因，能诱导药用植物产生发状根， 该发根能在液体培养基内快速生长，并表达药用植物的有效药用成分。山参(Mountain PanaxGinseng C.A.Meyer)根内含有人参皂苷较多，有些特殊人参皂苷仅在山参中存在，具抗癌作用，用量极微就有很好的疗效。目前，国内主要是从山参参根内提取人参皂苷供药用。但天然资源受气候的影响，季节性强，病虫害等也会严重影响山参的产量和质量；扩大山参的种植，必定与粮争地， 而我国的土地资源十分有限；而且，山参入药需15年以上的时间，其根头小，单产低，严重制约山参在生产上的应用。近30年来，随着生物技术的发展，利用发根农杆菌诱导药用植物产生发根，并利用发根来生产药用植物有效成分研究得越来越深入，这是因为其有以下优点:第一，天然山参资源有限；第二，山参中有无法替代的、特效的、高经济价值的药用成分，第三，可以实现山参中有效药用成分的室内可控生产。目前国内外均未见转化山参发根成功的报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种山参发根，解决了人工种植山参生长周期长、繁殖速度慢，遗传上不够稳定等不利因素，实现了室内生产山参。本专利技术还公开了上述山参发根的培育方法，以山参根、茎及叶片等为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根。本专利技术提供的山参发根，又称之为发根(hairy root);其特征在于:以山参根、茎及叶片等为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri 质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根，每一个发根即为一个单克隆。经过多次继代培养及反复筛选，逐步建立起山参发根悬浮培养无性系。本专利技术公开的山参发根的制备方法，其技术解决方案如下:以山参根、茎及叶片等为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri 质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根。每一根山参发根即为一个单克隆，经过继代培养和多次筛选，逐步建立起山参悬浮培养无性系。具体步骤如下:1、外植体的预培养:取山参新鲜、健康的根或茎或叶片，洗净；用0.1%的升汞灭菌lOmin，无菌水漂洗4次， 每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超净台上将外植体切成0.5cmX 1.0cm大小,转移到已灭菌的1/2MS固体培养基上(每瓶5片)；于黑暗条件下预培养2~7d。2、发根农杆菌的制备:挑取发根农杆菌单菌落，接种于5mL液体YEB内，28°C黑暗条件下振荡培养过夜，于次日接种到50ml液体YEB中继培养4~6h后备用。3、山参叶片与发根农杆菌共培养转化:将经过预培养的山参外植体浸入已培养好的发根农杆菌菌液中，感染5~10 min，然后，用无菌滤纸将菌液吸净；再接种于含抗生素 1/2MS固体培养基上，约经过30cT50d培养生出发根。4、发根培养:去菌培养:切割下由外植体上长出的发根，置于含抗生素(头孢噻吩30(T500mg/L) 1/2MS固体培养基上，进行去菌培养，每:T5d转继代I次，进行3飞次；扩大培养:将无菌的发根1.0g移入盛有50mL 1/2MS液体培养基的IOOmL三角瓶内，于黑暗条件下，室温22°C~25°C，llOrpm，悬浮培养。山参发根无性系的建立:经:T5代的悬浮培养，按发根克隆的来源分别建立不同的无性系。此外，利用本专利技术的山参发根产生的愈伤组织，还可筛选出细胞悬浮培养无性系。本专利技术与山参栽培根相比的积极效果在于:提供了一种新的山参资源，能够工业集约化生产，不需要占用耕地，不受天气、病虫害等自然界条件的影响，实现了山参有效药用成分生产化室内；解决了人工种植山参的生长周期长，需15年以上才能采收I次，并且受气候及病虫害影响大导致质量不稳定的问题；同时也克服山参繁殖速度慢，遗传上不够稳定等不利因素。山参发根可以周年不断地提供山参资源，并能保证质量的稳定，由于山参发根是在人工控制下的无菌培养，生长周期短(约 40d)，因此处理工艺成本较低。 本专利技术山参发根具有生物学特征如下:1、发根生长形态和农杆碱的鉴定:转化的山参发根无向地性，随机交叉‘无序’生长，多 ‘根毛’，多分枝，生长快，具有典型的转化发根特征。农杆碱的鉴定表明Ri质粒的T-DNA的确整合到山参细胞核DNA上，因为发根农杆菌所含冠瘿碱合成酶基因只能在真核生物中表达。2、生长曲线:为一典型的S形曲线。培养30d可增殖20倍(参见图4)。3、山参发根培养基的筛选:对常用的多种培养基进行比较的基础上，对基培养基进行了优化筛选。认为:1/2MS液体培养基对其生长有利。pH5.(T6.0。4、pH对山参发根生长的影响:在pH5.(T6.0的范围内，山参发根生长良好。5、蔗糖浓度对山参发根生长的影响:在发根培养中，蔗糖是作为碳源和能源，还可调节培养液渗透压，以蔗糖含量为2.(T4.0%为宜。6、外源激素对山参发根生长的影响:本山参发根在无激素培养液内可自行生长。7、山参发根次生代谢物质:HPLC分析表明，发根中人参皂苷与原植物中所含人参阜苷相同，含量相近。8、光对山参发根生长的影响:在室内自然光下，光对山参发根生长表现较强的抑制作用，其生物量仅为黑暗培养条件下的1/3。【专利附图】【附图说明】图1是实施例1转化山参发根培养的实物照片。图2是实施例2转化山参发根培养的实物照片。图3是实施例3转化山参发根培养的实物照片。图4为山参发根生长曲线。【具体实施方式】 实施例1 取山参新鲜健康的根洗净；用0.1%的升汞灭菌lOmin，无菌水漂洗4次，每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超净台上将叶片切成0.5cmX 1.0cm大小，于黑暗条件下预培养疒7d。将经过预培养的山参外植体浸入已培养好的发根农杆菌菌液中，感染5~10 min0再接种于含抗生素1/2MS固体培养基上(蔗糖含量为2%)，22°C~25°C下，约经过30d至50d培养生出发根。切割下长出的发根，置于含抗生素头孢噻吩300mg/L的1/2MS固体培养基上，进行去菌培养。在黑暗条件下，室温22~25°C，IlOrpm，将无菌的发根经3飞代的悬浮培养，可获得不同的发根无性系(参见图1转化山参发根培养的实物照片)。实施例2 取山参新鲜健康的茎洗净；用0.1%的升汞灭菌lOmin，无菌水漂洗4次，每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超净台上将叶片切成0.5cmX 1.0cm大小，于黑暗条件下预培养疒7d。将经过预培养的山参外植体浸入已培养好的发根本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山参发根的制备方法，其特征在于：以山参根、茎及叶片等为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒上的T?DNA上的致发根基因整合到山参外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根；每一根山参发根即为一个单克隆，经过继代培养和多次筛选，逐步建立起山参悬浮培养无性系。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李昌禹，王英平，卢淑波，艾军，郑培和，雷秀娟，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：