一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及到一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂。本发明专利技术的制备方法为：设计PCR引物扩增目的基因，构建重组表达质粒，筛选高表达细胞克隆，培养工程细胞，纯化。其中，纯化的步骤为：超滤浓缩、DEAE离子交换层析、Source15反相层析、超滤浓缩、分子筛层析。本发明专利技术还涉及一种含有重组人血小板生成素的制剂，所述的制剂为液体制剂，含有重组人血小板生成素、稳定剂和缓冲盐，稳定剂为磺丁基醚β环糊精，浓度为1～2wt%。本发明专利技术的方法制备得到的重组人血小板生成素的纯度为98.0～99.9%，活性为3.0×105～3.6×105U/mg，并且重组人血小板生成素的得率提高。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生物医药
，具体涉及到一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂。本专利技术的制备方法为：设计PCR引物扩增目的基因，构建重组表达质粒，筛选高表达细胞克隆，培养工程细胞，纯化。其中，纯化的步骤为：超滤浓缩、DEAE离子交换层析、Source15反相层析、超滤浓缩、分子筛层析。本专利技术还涉及一种含有重组人血小板生成素的制剂，所述的制剂为液体制剂，含有重组人血小板生成素、稳定剂和缓冲盐，稳定剂为磺丁基醚β环糊精，浓度为1～2wt%。本专利技术的方法制备得到的重组人血小板生成素的纯度为98.0～99.9%，活性为3.0×105～3.6×105U/mg，并且重组人血小板生成素的得率提高。【专利说明】一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及到一种重组人血小板生成素的制备方法及其制剂。
技术介绍
上世纪50年代，Kelemen等发现并提出体内存在着一种能够刺激血液中血小板生成的体液因子，并命名为ThiOmbopoietin(TPO),它对巨核细胞系统的发育和成熟有明显促进作用，但由于来源不足和缺乏适当的纯化手段，一直没有得到高纯度的TPO样品，致使几十年来对其研究几乎没有进展。直到1994年，美国、日本等几个研究小组相继报道了人、鼠TPO cDNA的全长序列，并完成了基因克隆、表达、纯化和鉴定。国际专利W09518858公开了重组人血小板生成素cDNA序列及合成、所采用的质粒的构建及培养和纯化手段，该专利采用的纯化手段操作工序复杂、产率较低、蛋白纯度不能满足临床需要，700L培养液最后仅获得蛋白250mg，纯度仅能保证90%以上。专利ZL01126803.4公开了一种新的重组人血小板生成素cDNA序列，该序列前N-39个氨基酸密码子发生了突变，从而可提高重组人血小板生成素的表达，但未见该专利公开其蛋白表达量和纯化方法。 专利ZL00109612.5公开了重组人血小板生成素特定的培养条件、纯化方法和制剂组成，该专利所采用的纯化工艺复杂，需经过超滤、阳离子交换层析、凝胶层析、阴离子交换层析、反相高效液相层析和凝胶过滤层析等多个步骤方可获可药用的蛋白，且最后40L培养液仅获得260mg蛋白，收率较低，不适合大规模生产。综上所述，目前仍需对表达系统的选择、培养方法的选择、纯化工艺的建立等方面进行深入的研究已获得高收率、低成本的重组人血小板生成素。专利ZL01126803.4公开了重组人血小板生成素制剂所采用的稳定剂为人血白蛋白，由于国内人血白蛋白资源紧张且存在一定的安全风险，因而我们对稳定剂进行了研究和选择，发现在柠檬酸和柠檬酸钠的缓冲盐体系下，磺丁基醚β环糊精对重组人血小板生成素有良好的稳定作用。
技术实现思路
本专利技术的首要专利技术目的在于提出了一种重组人血小板生成素的制备方法。本专利技术的第二专利技术目的在于提出了一种重组人血小板生成素的制剂。为了实现本专利技术的目的，采用的技术方案为:一种重组人血小板生成素的制备方法，具体包括以下步骤:(I)设计PCR引物扩增目的基因:将人胚肾细胞获得的TPO-cDNA序列与设计的引物进行扩增，扩增重组人血小板生成素cDNA序列的PCR引物为:上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；(2)构建重组表达质粒:将质粒pLIOl和扩增得到的TPO-cDNA重组，得到重组pLIOl/TPO 质粒；(3)筛选高表达细胞克隆:pL101/TP0转化至CHO细胞后通过反复转染、硫氨甲硫氨酸筛选获得高表达的克隆细胞，作为工程细胞；(4)培养工程细胞；(5)纯化:培养获得的上清液依次采用第一次超滤、DEAE离子交换层析、SourCel5反相层析、第二次超滤浓缩、分子筛层析的纯化手段获得重组人血小板生成素。本专利技术的第一优选技术方案为:在步骤(4)中，工程细胞的培养条件为:采用ExCel 1325-PF无血清培养基，葡萄糖的添加量为0.5~1.5g/L，无水碳酸氢钠的添加量为1.0 ~2.5g/L。 本专利技术的第二优选技术方案为:在步骤(5)中，DEAE离子交换层析的条件为:用平衡缓冲液平衡层析柱(填料DEAE-S印harose FF，层析柱规格XK50/100)，经过第一次超滤后的样品上柱，流速20~30ml/min ;上样完毕，用平衡缓冲液冲洗至UV值接近基线；用洗涤缓冲液洗涤样品，流速为40~50mL/min ;用平衡缓冲液平衡柱子，流速40~50mL/min ;平衡完毕，用洗脱液洗脱，流速40~50mL/min ;收集洗脱过程的紫外峰。其中，平衡缓冲液为20mmol/L PB 的溶液，pH7.0 ;洗漆缓冲液为含有 6mol/L Urea、1.2mmol/L 甘氨酸、0.6ml/LHAc的混合溶液，所述的洗脱液为含有20mmol/L PBU50mmol/LNacl的混合溶液，pH7.0 ；用量为3~5个柱体积。本专利技术的第三优选技术方案为:在步骤(5)中，S0urcel5RPC反相层析的条件为:用平衡缓冲液平衡S0urcel5RPC反相层析柱，流速20~30mL/min ;样品上柱，流速10~20mL/min ;用平衡缓冲液冲洗至UV值接近基线，流速20~30mL/min ;连续梯度洗脱样品，起始梯度 100%Buffer A、0%Buffer B ;最终梯度 0%Buffer A、100%Buffer B ;梯度时间60min,流速30mL/min ;收集洗脱梯度从45%Buffer B到75%Buffer B的蛋白洗脱峰；梯度结束，换用梯度，从0%Buffer A、100%Buffer B到 100%Buffer A、0%Buffer B，梯度时间 IOmin ;BufferA为Smmol /T, Tris/Hcl溶液，pH8.5, Buffer B为85%乙醇溶液。其中，平衡缓冲液为5mmol/LTris/HCl的溶液，pH8.5，用量为3~5个柱体积。本专利技术的第四优选技术方案为:在步骤(5)中，所述的S-200分子筛层析(填料粒径为ΙΟμπι~40μπι，层析柱规格XK50/100)的条件为:柠檬酸缓冲液平衡柱子，把得到的超滤浓缩液分几次上样，上样体积为柱体积的3~5%，流速为5~10mL/min ;上样完毕，用柠檬酸缓冲液洗脱，流速5~10mL/min，收集洗脱峰。其中，柠檬酸缓冲液为含有20mmol/L柠檬酸、150mmol/L NaCl的混合溶液，pH6.9。本专利技术的第五优选技术方案为:本专利技术制备得到的重组人血小板生成素的纯度为98.0 ~99.9%,活性为 3 X IO5 ~3.6 X 105U/mg。本专利技术还涉及采用制备方法制备的重组人血小板生成素的制剂，所述的制剂为液体制剂，所述的制剂中含有重组人血小板生成素、稳定剂和缓冲盐，所述的稳定剂为磺丁基醚β环糊精，所述的缓冲剂为柠檬酸与柠檬酸钠组成的缓冲体系。其中，所述制剂中每毫升含有重组人血小板生成素40~80 μ g、柠檬酸钠5.2~6.6mg、柠檬酸0.04~0.08mg、NaC15.2~6.6mg、磺丁基醚β环糊精10~20mg ;优选含有重组人血小板生成素60 μ g、柠檬酸钠5.8mg、柠檬酸0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人血小板生成素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计PCR引物扩增目的基因：将人胚肾细胞获得的TPO?cDNA序列与设计的引物进行扩增，扩增重组人血小板生成素cDNA序列的PCR引物为：上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；（2）构建重组表达质粒：将质粒pL101和扩增得到的TPO?cDNA重组，得到重组pL101/TPO质粒；（3）筛选高表达细胞克隆：pL101/TPO转化至CHO细胞后通过反复转染、硫氨甲硫氨酸筛选获得高表达的克隆细胞，作为工程细胞；（4）培养工程细胞；（5）纯化：培养获得的上清液依次采用第一次超滤、DEAE离子交换层析、Source15反相层析、第二次超滤浓缩、分子筛层析的纯化手段获得重组人血小板生成素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钟正明，
申请(专利权)人：江苏康禾生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：