本发明专利技术涉及一种具有长效作用的聚乙二醇化血小板生成素模拟肽同源四聚体的制备方法及其用途。通过氨基末端为半胱氨酸残基的血小板生成素模拟肽二聚体与聚乙二醇分子两端偶联而成的聚乙二醇化血小板生成素模拟肽同源四聚体，具有长效升高外周血血小板数量的功能，可作为一种血小板减少症的治疗药物，包括特发性血小板减少性紫癜、化疗引起的血小板减少症、肝炎引起的血小板减少综合症及骨髓增生异常综合症等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种聚乙二醇化血小板生成素模拟肽同源四聚体的制备及用途，属于生物技术及药物领域。
技术介绍
血小板减少症是临床上常遇到的疾病，常见于肿瘤放疗、化疗和骨髓移植患者，也见于特发性血小板减少性紫癜(ITP)、肝炎诱发的血小板减少综合征、骨髓增生异常综合征(MDS)及慢性肝病。血小板减少症是一种常见的血液病，肿瘤患者接受化疗和放疗后，骨髓受到不同程度的抑制，造成贫血、粒细胞减少和血小板减少。临床上已有重组的长效和短效EPO和G-CSF治疗贫血和粒细胞减少症，短效的重组IL-1l和TPO用于放化疗后血小板减少症，长效的Nplate用于特发性血小板减少紫癜的治疗。血小板生成素(Thrombopoietin, ΤΡ0)是调节血小板生成最主要的细胞因子，它能专一的促进巨核细胞的生长发育和血小板的生成。人内源性TPO由332个氨基酸组成，N端为其受体结合位点，C端为高度糖基化部分(Bartley etal.,CelI 77:1117-1124(1994) ; Chang et al., Journal of B1logical Chemistry270:511-514(1995) )。TPO主要在肝脏、骨髓基质细胞及肾脏合成，通过与其受体c-Mpl结合，激活信号通路，促进巨核细胞增殖分化从而介导血小板生成(Blood 82:1395-1401，1993 ；Blood 87:2162-2170，1996)。血小板生成素模拟肽(Thrombopoietin Mimetic Peptide, TMP)是与TPO具有相似功能但不具同源结构的多肽物质，由Cwirla等从丝状噬菌体展示肽库中筛选到高活性的TPO模拟肽(AF12505)。该血小板生成素模拟肽为线性肽，其氨基酸组成为Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala,具有刺激 TPO 依赖性细胞株 Ba/ F3_mpl的增殖功能，EC50为400nmol/L (Science 276:1696-1699，1997)。但该结构的活性肽体内生物学活性偏低，半衰期极短，难以满足作为一种治疗性药物的临床应用的需要。且进一步研究发现，TMP不会像重组TPO —样，在体内诱导产生与人TPO交叉反应的中和抗体(NatureB1technology 15:1261-1265，1997)，提示具有优于TPO的临床应用前景。为克服TMP多肽在体内半衰期过短的缺陷，Amgen公司设计并开发成功了重组TMP-FC融合蛋白，用于临床治疗脾切除和脾未切除慢性免疫性血小板减少性紫癜(ITP);具有一周皮下给药一次的长效作用，于2008年8月获得美国FDA批准上市，商品名Nplate。Nplate包含2个相同的单链亚单元，每个单链包含IgG Fe恒定区域和TPO模拟肽，C末端由二硫键链接而成，其中TPO模拟肽包含2个串联的TMP多肽序列，Fe区域实现体内长效功能(CN 1810832A)。本专利技术提供了一种衍生于TPO模拟肽AF12505的血小板生成素模拟肽的二聚体，该二聚体通过含氨基末端为半胱氨酸的巯基与双活化的聚乙二醇分子共价偶联成同源四聚体偶联物。本专利技术人经研究发现，该聚乙二醇化血小板生成素模拟肽同源四聚体偶联物实现了体内血液半衰期的极大延长，在实验动物体内单次注射给药后显著促进外周血血小板数量增加的功效，可作为一种新型的长效治疗血小板减少症的药物或者药物组合物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有长效作用的血小板生成素模拟肽的同源四聚体，以及实现该同源四聚体的制备方法，用于作为治疗血小板减少症的药物。本专利技术中血小板生成素模拟肽二聚体(代号NPC)的氨基酸序列衍生于TPO模拟肽AF12505，具有以下特征:NH2-Cys-(Gly)n-1le-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala- (Gly)m-1Ie-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala-COOH 其中η和m为5-10的整数，(Gly) η优选为5，即GlyGlyGlyGlyGly ; (Gly)m优选为8，即 GlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyo此外技术人员可按本领域常规方法设计(Gly) η和(Gly)m为5_10个Gly的序列，而不影响本专利的实现。本专利技术提供的血小板生成素模拟肽二聚体序列SEQ ID NO:1的显著特征是N端氨基酸残基是半胱氨酸。本专利技术的另一目的是提供制备血小板生成素模拟肽同源四聚体的制备方法和实施过程。通过血小板生成素模拟肽二聚体氨基末端半胱氨酸的游离巯基(或称硫代基团)在一定反应条件下形成二硫键而成。本专利技术实施的另一方案是通过双活化的聚乙二醇分子作为偶联物，与血小板生成素模拟肽二聚体氨基末端半胱氨酸的游离巯基在一定反应条件下形成共价的聚乙二醇偶联同源四聚体，具有以下特征: 双活化的聚乙二醇分子(PEG)是一类不含有甲氧基或者羟基、双端均被相同基团活化、可与硫代基团发生共价偶联的聚乙二醇。包括双活化的马来酰亚胺聚乙二醇，特征为mal-PEG-mal ;或包括双活化的巯基聚乙二醇，特征为SH-PEG-SH;或包括双活化的邻二硫吡啶聚乙二醇，特征为0PSS-PEG-0PSS ;或包括双活化的乙烯基砜聚乙二醇，特征为VS-PEG-VS0用于本专利技术中血小板生成素模拟肽类似物同源二聚体的聚乙二醇分子可是小分子或是大分子，分子量范围从5,000-40,000道尔顿。通过分子量大于5，000的聚乙二醇分子作为二聚体偶联物可实现将血小板生成素模拟肽类似物二聚体在体内半衰期的显著延长。优选的聚乙二醇分子大小是20，000-40，000道尔顿之间。本专利技术的另一目的是提供了用于制备血小板生成素模拟肽二聚体的化学固相合成或者重组DNA技术的方法。重组DNA技术指应用表达载体插入编码血小板生成素模拟肽二聚体的cDNA基因片段后，转化宿主细胞。再经发酵或培养、纯化制备相应重组多肽的技术过程。本专利技术的另一目的，提供了分离和制备血小板生成素模拟肽类似物同源二聚体的方法，包括总所周知的离子交换色谱、亲和色谱、疏水层析以及反向层析色谱、分子排阻色谱和超滤等技术手段。本专利技术的另一目的，提供了聚乙二醇化血小板生成素模拟肽同源四聚体的升高外周血血小板作用，可作为治疗血小板减少症的药物或药物组合物。作为一种药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效剂量的本专利技术所述的同源四聚体多肽聚乙二醇偶联物。本专利技术中所用的“同源四聚体”，是指通过共价结合键将氨基酸序列和组成完全相同的血小板生成素模拟肽二聚体在氨基末端共价结合而形成的四聚体。本专利技术中所用的“聚乙二醇偶联”是指由不同大小分子量的聚乙二醇在两端分别与一个血小板生成素模拟肽二聚体的氨基末端共价而生成的聚乙二醇化同源四聚体。本专利技术中所用“表达载体”，是指含有表达启动子包括T7、Tac、Trp、Iac的大肠杆菌表达载体，或含有ct分泌因子以及AOX或GAP表达启动子的酵母表达载体。至此已对本专利技术进行了详细的描述，通过参考下列实例，能够对本专利技术有更清晰的本文档来自技高网...
【技术保护点】
聚乙二醇化血小板生成素模拟肽同源四聚体，其特征是通过血小板生成素模拟肽二聚体氨基末端的半胱氨酸残基与双活化的聚乙二醇偶联而成，其中（1）血小板生成素模拟肽二聚体（代号NPC）的序列特征为：NH2‑Cys‑(Gly)n‑Ile‑Glu‑Gly‑Pro‑Thr‑Leu‑Arg‑Gln‑Trp‑Leu‑Ala‑Ala‑Arg‑Ala‑(Gly)m‑Ile‑Glu‑Gly‑Pro‑Thr‑Leu‑Arg‑Gln‑Trp‑Leu‑Ala‑Ala‑Arg‑Ala‑COOH其中n和m为5‑10的整数；（2）聚乙二醇化血小板生成素模拟肽同源四聚体的结构特征为NPC‑(CH2‑CH2)n‑NPC其中n为100‑1000，CH2‑CH2为乙二醇；（3）血小板生成素模拟肽二聚体（NPC）的氨基末端半胱氨酸的巯基与活化的聚乙二醇分子共价偶联。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈清，范开，陈海容，
申请(专利权)人：重庆派金生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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