【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体地，涉及一种聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶及变异体的制剂和药物组合物。
技术介绍
1、精氨酸是一种可以在哺乳动物体内自然产生的非必需氨基酸，它参与组织细胞蛋白质、尿素、肌酸、肌酐、一氧化氮、谷氨酰胺、嘧啶等的合成。正常的细胞可以依赖精氨酰琥珀酸合成酶利用瓜氨酸合成精氨酸。然而在某些肿瘤细胞，如肝癌细胞、黑色素瘤细胞中，精氨酰琥珀酸合成酶通路缺失，无法自身合成精氨酸，只能依赖外源的精氨酸存活，而当外源精氨酸缺乏时，肿瘤细胞就会被“饿死”，增殖受到抑制。这一特点为治疗精氨酸依赖的肿瘤提供了新思路，即通过降低血清中精氨酸的水平、阻断外源精氨酸供给，造成肿瘤细胞营养缺乏，实现特异性的抑制肿瘤细胞增殖。
2、精氨酸酶脱亚胺酶(arginine deiminase，ec3.5.3.6，简称adi)是一种能将精氨酸分解为瓜氨酸和氨的微生物来源酶。不同来源的精氨酸脱亚胺酶结构不一样，生理活性也有差异。例如从恶臭单胞菌(pseudomonas putida)中提取的精氨酸脱亚胺酶在体外可以有效杀死癌细胞(jones jb 1981)，但在生理ph条件下几乎没有活性，因而不能应用于体内，目前已有适应于生理ph条件下有活性的结构改造报道。而支原体来源的精氨酸脱亚胺酶与恶臭单胞菌来源的adi不同，在生理条件下表现出很高的活性。
3、作为一种治疗药物，精氨酸脱亚胺酶具有一般蛋白药物的不足，即稳定性差，容易降解，在体内半衰期短。此外，精氨酸脱亚胺酶也是一种外源性蛋白质，具有较强的免疫原性，诱发机体产生抗体使
4、聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶为二聚体，同时含有多个peg，在储存、运输和使用过程中容易出现解聚、高聚体形成、酶活性损失、peg脱落等影响药效和质量的关键因素。本专利技术对不同的制剂处方进行比较和研究，筛选能够最大限度保持活性和蛋白分子状态的处方组成。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是通过对聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶的制剂配方进行更多和范围更大的筛选，提供一种可以长时间保持蛋白聚合体稳定性和活性、更适合临床应用的制剂处方组成。本专利技术的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶组合物剂型为注射液或冻干粉，包含聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶、保护剂和缓冲盐。本专利技术提供的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶组合物有效地避免了精氨酸脱亚胺酶因盐、震荡、ph和温度的影响而导致的物理变化和化学变化，特别是能解决高温、震荡、冻融和冻干的过程稳定性的技术难题。
2、本专利技术中精氨酸脱亚胺酶具有seq id no:1所示的氨基酸序列；或与seq id no:1相比具有至少90％以上同源性；或与seq id no:1相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的变异体，所述seq id no:1所示的氨基酸序列中含有二个半胱氨酸，经重组表达形成共价二聚体。
3、根据本专利技术的实施例，所述精氨酸脱亚胺酶具有seq id no:1所示的氨基酸序列。
4、seq id no:1
5、svfdskfngihvyseigeletvlvhepgreidyitparldellfscileshdarkehqsfvkimkdrginvveltdlvaetydlaskaakeefietfleetvpvlteankkavrafllskpthemvefmmsgitkyelgvesenelivdpmpnlyftrdpfasvgngvtihfmryivrrretlfarfvfrnhpklvktpwyydpamkmpieggdvfiynnetlvvgvsertdldtitllaknikankevefkrivainvpkwtnlmhldtwltmldknkflyspiandvfkfwdydlvnggaepqpqlnglpldkllasiinkepvlipiggagatemeiaretnfdgtnylaikpglvigydrnektnaalkaagitvlpfhgnqlslgmgnarcmsmplsrkdvkw
6、所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体为所述精氨酸脱亚胺酶序列中的赖氨酸ε氨基与聚乙二醇形成共价键而构成的偶联物。
7、所述聚乙二醇为直链或支链结构；
8、所述聚乙二醇分子量为3-30kda，优选5kda；
9、所述聚乙二醇与精氨酸脱亚胺酶通过酰胺键偶联；
10、所述聚乙二醇为聚乙二醇活性酯，所述聚乙二醇的活性基团选自下列的至少一种：
11、n羟基琥珀酰亚胺、n羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、n羟基琥珀酰亚胺乙酸酯、n羟基琥珀酰亚胺丙酸酯、n羟基琥珀酰亚胺丁酸酯、n羟基琥珀酰亚胺琥珀酸酯和对硝基苯碳酸酯。
12、优选地，所述聚乙二醇的活性基团为n羟基琥珀酰亚胺丙酸酯。
13、优选地，所述聚乙二醇为5kda的直链spa-peg(methoxy peg succinimidylpropionate甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺基丙酸酯)。
14、具体地，所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体，一分子精氨酸脱亚胺酶共价偶联16～32个聚乙二醇，优选25-30个。
15、经聚乙二醇修饰形成聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶共价二聚体，该共价二聚体在储存、运输和使用过程中容易出现亚基间二硫键断裂、高聚体形成、酶活性损失等影响药效和质量的关键因素。因此本专利技术提出了一种新的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶共价二聚体的制剂处方。所述制剂在水溶液状态下包括以下组分：
16、(1)5-20mg/ml聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶。
17、(2)含有3％-8％的保护剂，所述保护剂蔗糖、海藻糖、甘露醇和精氨酸中的一种或多种，优选蔗糖。
18、(3)酸碱度为6.5-7.5的缓冲盐，缓冲盐选自磷酸盐或tris-hcl，离子浓度为10～100mmol/l。
19、根据治疗有效量确定聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶注射剂的浓度，优选地，所述聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶浓度为9.0～11.0mg/ml。
20、优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/l。
21、优选地，所述注射剂的ph为7.0±0.3。
22、优选地，所述保护剂为蔗糖，浓度为5.5％。
23、优选地，所述精氨酸脱亚胺酶注射剂存储于玻璃瓶中。
24、所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶组合物的剂型为水针或冻干粉，所述的冻干粉是指将上述任一水溶液状态下的制剂经冷冻干燥而成。在某些实施例中，上述制剂经冷冻干燥后的加速、高温考察的稳定性优于不含保护剂的制剂配方。
25、本专利技术还提供了聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶组合物在制备药物中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.精氨酸脱亚胺酶二聚体，其特征在于：精氨酸脱亚胺酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:1相比具有至少90％以上同源性；或与SEQ ID NO:1相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的变异体，所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中含有二个半胱氨酸，经重组表达形成共价二聚体。
2.聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体，其特征在于：所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体为权利要求1所述精氨酸脱亚胺酶序列中的赖氨酸ε氨基与聚乙二醇形成共价键而构成的偶联物。
3.根据权利要求2所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体，其特征在于：所述聚乙二醇为直链或支链结构，所述聚乙二醇分子量为3-30KDa，聚乙二醇与精氨酸脱亚胺酶形成共价键为酰胺键。
4.根据权利要求2所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体，其特征在于：一分子精氨酸脱亚胺酶共价偶联16～32个聚乙二醇，优选25-30个。
5.根据权利要求2或3或4所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体，其特征在于：所述聚乙二醇为聚乙二醇活性酯，所述聚乙二醇的活性基团选自下列至
6.聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体制剂，其特征在于：包括权利要求2-5任一项所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体，其水溶液状态下5-20mg/mL的添加物：包括3％-8％的保护剂，酸碱度为6.5-7.5的缓冲盐。
7.根据权利要求6所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体制剂，其特征在于：所述保护剂选自蔗糖、海藻糖和精氨酸中的一中或多种，所述缓冲盐为磷酸盐或Tris-Hcl，浓度为10～100mmol/L。
8.根据权利要求6所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体制剂，其特征在于：所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体的浓度为9～11mg/mL，5.5％蔗糖，磷酸盐50mmol/L，pH 7.0±0.3。
9.根据权利要求6-8任一项所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体制剂，其特征在于：该制剂的剂型为水针或冻干粉。
10.权利要求6-9任一项所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤；所述肿瘤为肝细胞癌、肺间皮癌、黑色素瘤、卵巢癌。
...【技术特征摘要】
1.精氨酸脱亚胺酶二聚体，其特征在于：精氨酸脱亚胺酶具有seq id no:1所示的氨基酸序列；或与seq id no:1相比具有至少90％以上同源性；或与seq id no:1相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的变异体，所述seq id no:1所示的氨基酸序列中含有二个半胱氨酸，经重组表达形成共价二聚体。
2.聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体，其特征在于：所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体为权利要求1所述精氨酸脱亚胺酶序列中的赖氨酸ε氨基与聚乙二醇形成共价键而构成的偶联物。
3.根据权利要求2所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体，其特征在于：所述聚乙二醇为直链或支链结构，所述聚乙二醇分子量为3-30kda，聚乙二醇与精氨酸脱亚胺酶形成共价键为酰胺键。
4.根据权利要求2所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体，其特征在于：一分子精氨酸脱亚胺酶共价偶联16～32个聚乙二醇，优选25-30个。
5.根据权利要求2或3或4所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶二聚体，其特征在于：所述聚乙二醇为聚乙二醇活性酯，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁琼，唐光辉，何云凤，聂堂伟，文海燕，
申请(专利权)人：重庆派金生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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