【技术实现步骤摘要】
TALE重复单元四聚体库的构建方法、TALEN表达载体的构建方法及其应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种TALE重复单元四聚体库的构建方法、TALEN表达载体的构建方法及其应用，具体涉及组装多个TALE重复序列，同时将组装的重复序列插入TALEN表达载体的方法，该方法基于Golden Gate克隆技术。
技术介绍
基因组靶向修饰是近年来生命科学研究的热点之一，特别是在基因治疗人类疾病方面，基因组靶向修饰具有广阔的应用前景。通过转基因或者基因敲除等操作改变动物基因的遗传组成，可按人们的意愿对动物进行各种基因改造，获得满足各种需要的基因工程动物。当前转基因动物生产中面临的最大技术难题是动物基因组中外源基因的插入或特定基因敲除的效率低和精确性差。传统较常用的转基因方法为同源重组法和反转录病毒携带法。但同源重组法成功率低(重组概率为10_6 10_7)，而反转录病毒携带目的基因的随机插入法虽效率高，但由于其插入位点的不确定性和对其它内源基因表达的影响，限制了该方法的应用。人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases, ZFNs)技术是一种能够对基因组进行精确定点修饰的技术。ZFN利用了锌指蛋白特异结合DNA的特性和Fok I核酸酶非特异的DNA切割特性，能够在靶基因特定位点切割DNA双链，细胞内部DNA断裂修复机制能够有效地将含有同源片段的外源基因插入到DNA断裂处，从而实现高效、定点转基因，该技术介导的转基因成功率高达20%。尽管锌指核酸酶技术的出现促使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步，然而目前对于许多研究者而言设计出高效、高特异性的锌...
【技术保护点】
TALE重复单元四聚体库的构建方法，包括下述步骤：(1)、PCR扩增TALE单个重复单元：以TALE单个重复片段monomer?NI为模板，用TALE?F1/TALE?R1为引物PCR扩增得到TALE单体NI1、NI2、NI3、NI4；以TALE单个重复片段monomer?NG为模板，用TALE?F2/TALE?R2为引物PCR扩增得到TALE单体NG1、NG2、NG3、NG4；以TALE单个重复片段monomer?HD为模板，用TALE?F3/TALE?R3为引物PCR扩增得到TALE单体HD1、HD2、HD3、HD4；以TALE单个重复片段monomer?NN为模板，用TALE?F4/TALE?R4为引物PCR扩增得到TALE单体NN1、NN2、NN3、NN4，其中monomer?NI识别A碱基、monomer?NG识别T碱基、monomer?HD识别C碱基、monomer?NN识别G碱基；(2)、将步骤(1)构建所得的TALE单体插入线性化pGEM?T?easy载体中，得到相应的16个TALE单体质粒pGEM?T?NI1、pGEM?T?NI2、pGEM?T?NI3、pGEM?T?...
【技术特征摘要】
1.TALE重复单元四聚体库的构建方法，包括下述步骤: (1)、PCR扩增TALE单个重复单元:以TALE单个重复片段monomerNI为模板，用TALE-F1/TALE-R1为引物PCR扩增得到TALE单体NI1、NI2、NI3、NI4 ;以TALE单个重复片段monomer NG 为模板，用 TALE-F2/TALE-R2 为引物 PCR扩增得到 TALE 单体NGl、NG2、NG3、NG4 ；以TALE单个重复片段monomer HD为模板，用TALE-F3/TALE-R3为引物PCR扩增得到TALE单体 HD1、HD2、HD3、HD4 ；以 TALE 单个重复片段 monomer NN 为模板，用 TALE-F4/TALE-R4 为引物 PCR 扩增得到 TALE 单体 NN1、NN2、NN3、NN4，其中 monomer NI 识别 A 碱基、monomer NG识别T碱基、monomer HD识别C碱基、monomer NN识别G碱基； (2)、将步骤(I)构建所得的TALE单体插入线性化pGEM-Teasy载体中，得到相应的 16 个 TALE 单体质粒 pGEM-T-NIl、pGEM_T_NI2、pGEM_T_NI3、pGEM_T_NI4、pGEM-T-NGl、PGEM-T-NG2、pGEM_T_NG3、pGEM_T_NG4、pGEM-T-HD1、pGEM_T_HD2、pGEM_T_HD3、pGEM_T_HD4、pGEM-T-剛1、pGEM-T-剛2、pGEM_T_NN3 和 pGEM_T_剛4 ； (3)、在T4DNA连接酶缓冲液中加入TALE单体质粒，同时加入BsaI内切酶和T4DNALigase进行酶切-连接反应，所述TALE单体质粒为pGEMT-Momomerl，pGEMT-Monomer2, pGEMT_Monomer3 和 pGEMT_Monomer4,得到含 256 个四聚体质粒的 TALE重复单元四聚体库，其中 pGEMT-Momomerl 为 pGEM-T-NIl、pGEM-T-HDl、pGEM-T-NGl 或pGEM-T-NNl 中的一个，pGEMT-Monomer2 为 pGEM_T_NI2、pGEM_T_HD2、pGEM_T_NG2 或PGEM-T-NN2 中的一个，pGEMT-Monomer3 为 pGEM_T_NI3、pGEM_T_HD3、pGEM_T_NG3 或PGEM-T-NN3 中的一个，pGEMT_Monomer4 为 pGEM_T_NI4、pGEM_T_HD4、pGEM_T_NG4 或pGEM-T-NM 中的一个。2.根据权利要求1所述的TALE重复单元四聚体库的构建方法，其特征在于，步骤(I)中PCR扩增的体系为模板I μ L、正向引物I μ L、反向引物IyLUOXTaq Buffer 5 μ L、.2.5mmol/L dNTPs 4 μ L, Taq DNApolymerase 0.5 μ L 和 H2O 37.5 μ L ;PCR 扩增的反应条件为:95°C预变性5min ;95°C变性30s，54。。退火30s，72。。延伸40s，扩增30个循环；72°C延伸 IOmin03.根据权利要求1所述的 TALE重复单元四聚体库的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中TALE单体插入线性化pGEM-T easy载体中的具体步骤为TALE单体与末端含T碱基的线性化pGEM-T easy载体连接，连接体系为线性化pGEM_T easy载体I μ L、TALE单体I μ L、10 X T4DNA 酶 Buffer I μ L、T4 连接酶 I μ L 和 H2O 6 μ L。4.根据权利要求1所述的TALE重复单元四聚体库的构建方法，其特征在于，步骤(3)中的酶切-连接反应体系为 pGEMT-Momomerl2 μ L、pGEMT-Momomer22 μ L、pGEMT-Momomer32 μ L、pGEMT_Momomer42 μ L、10 X T4DNA 酶 Buffer 2 μ L、BsaI 0.5 μ L、T4连接酶 0.5μ I^PH2O 9μ L ;反应条件为首先 37°C 5min，16°C 5min，循环 30 次；16°C IOh ；.65 °C 20min。5.TALEN表达载体的构建方法，包括权利要求1-4中所述的TALE重复单元四聚体库的构建过程，该TALEN表达载体的构建方法还包括下述步骤: (A)、将含14个碱基的靶向序列中由TALEN骨架载体N端决定的第一个T碱基和.0.5个重复单元决定的最后一个碱基之间的12个碱基序列按照从N端到C端的顺序分成NNNN(l-4)、NNNN(5-8)和NNNN(9_12)三个碱基组，从权利要求1_4中所述方法构建的TALE重复单元四聚体库中筛选与碱基组对应的pGEM-T-NNNN(l-4)、pGEM-T-NNNN(5-8)和pGEM-T-NNNN(9-12)，其中 N 为 A、T、C 或 G 中的一种； (B)、以pGEM-T-NNNN (1-4)为模板，用 Tetramer-Fl/Tetramer-Rl 引物对进行 PCR 扩增，得到片段 TALE-NNNN (1-4) ; WpGEM-T-NNNN (5-8)为模板，用 Tetramer_F2/Tetramer-R2引物对进行PCR扩增，得到片段TALE-NNNN (5-8)；以pGEM-T-NNNN (9-12)为模板，用Tetramer-F3/Tetramer-R3 引物对进行 PCR 扩增，得到片段 TALE_NNNN(9_12)； (C)、以pLent1-EFIa-Backbone (N13)为模板，以 TAL-N-F/TAL-C-R 为引物 PCR 扩增，扩增产物经XbaI和BamHI双酶切后与同样经XbaI和BamHI双酶切的pST1374载体进行连接，得到TALE...
【专利技术属性】
技术研发人员：张智英，张志强，李铎，辛颖，麻丽霞，王昕，张涛，徐华荣，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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