二聚体化融合蛋白的制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了二聚体化促血小板生成素(TPO)模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白的制备及应用。所述融合蛋白包含1个HSA和2个TPO模拟肽TMP通过连接短肽及二聚体化结构域连接，保证融合蛋白在表达时正确二聚体化。2个TPO模拟肽可以连接于HSA的N末端或C末端。本发明专利技术所提供的二聚体化HSA蛋白载体与TPO模拟肽融合蛋白具有显著的体内促血小板生成活性，可在制备治疗原发性和继发性血小板减少症疾病的药物中应用。

【技术实现步骤摘要】
二聚体化融合蛋白的制备及应用
本专利技术属于基因工程制药领域，具体涉及二聚体化促血小板生成素模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法及应用。专利技术背景大多数治疗用的蛋白和多肽半衰期一般较短(金光泽等，2010)，需要频繁注射；而且这类上市药物价格较高。这给需要长期应用治疗蛋白和多肽的患者带来难以承受的身体负担、心理负担和经济负担。因此，延长这些治疗蛋白与活性多肽半衰期的蛋白质工程改造已成为研究的热点，对长效重组蛋白和活性多肽药物的开发也已成为对第一代基因工程产品进行二次开发的一个重要方向(赵洪亮等，2005)。延长治疗用蛋白和多肽的半衰期通常采用的方法之一是进行突变体的构建。长效EPO(促红细胞生成素，Aranesp，安进公司生产)和长效胰岛素(Lantus，Aventis公司生产)就是采用突变体的方法获得的(戚楠和马清钧，2006)。可是，事实上能够采用这种方法达到延长活性多肽和蛋白在体内半衰期目的的药物寥寥无几。多数目标物经过突变后会带来抗原性增强，这样的药物注射给人体后，会导致中和性抗体的产生。第二种方法是化学修饰法，这方面，尽管聚乙二醇修饰的干扰素等长效药物业已上市，但是采用这类大分子化合物进行修饰所带来的目的物不均一性问题目前尚难以解决(姜和和龚梦嘉，2012)。近年来，研究人员通过将半衰期短的多肽、蛋白与载体蛋白相偶联，结果目的物在体内的半衰期显著延长。目前的工作已证明，抗体的Fc段和人血清白蛋白可用作这类蛋白载体。然而，抗体的Fc段不是一个惰性蛋白，它在体内可介导多种免疫响应，而且Amgen公司对Fc段的变体已在我国申请专利。因此，将Fc用作蛋白载体的应用大大受限。人血清白蛋白(HSA)是人体血浆的主要成分，由585个氨基酸组成，相对分子量约66.5KDa，为单链球型蛋白质。HSA是血液中最主要、最基本的载体蛋白，无酶学及免疫学活性，可携带并传递多肽、脂肪酸、类固醇以及激素(富岩等，2011)。由于HSA是一种惰性蛋白，能够抵御体内的酶解作用，在体内的半衰期可长达14～20天(ChuangandOtagiri，2002)。目前，常将它作为许多内源因子和外源药物的载体，将这些内源因子或外源药物与HSA融合后，可以增加它们的分子量和水化半径，减少它们被肾小球的滤过率，减少它们在体内利用度，以改善活性肽或蛋白药物的体内半衰期。1992年，Yeh等人首次提出将HSA作为载体蛋白与CD4偶联，采用酵母表达融合蛋白，获得了治疗人类疾病的长效融合蛋白药物。美国人类基因组科学公司(HGSI)研究开发的HSA-IFNα(Albuferonα)将IFNα的体内半衰期延长至144小时，目前已完成了三期临床试验。该公司开发的白蛋白生长激素(Albutropin)给予猕猴皮下注射，结果表明：与生长激素相比，白蛋白生长激素半衰期延长6倍(Osbornetal.，2002)；白蛋白-粒细胞生长因子(Albugranin)(Halpernetal.，2002)、白蛋白-B型脑利钠肽(Wangetal.，2004)、白蛋白-人胰岛素(Duttaroyetal.，2005)、白蛋白IL-2(Melderetal.，2005)均处于I/II期临床试验阶段。近些年来，我国也有大量研究采用白蛋白作为载体以获得长效药物(唱韶红等，2006；富岩等，2011；郭泽峰等，2008；黄迎春等，2011；金光泽等，2010；丁月娣等，2009；李道远等，2009；刘俊丽等2011；王楠等，2007；龙娟等，2008；张梅等，2009；张国新等，2008；周利苹等，2008)。采用白蛋白融合方法延长活性肽或蛋白药物体内的半衰期已成为一种通行的技术。促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)由332个氨基酸组成，含有两个功能区域：153个氨基酸组成的N端以及179个氨基酸组成的C端。TPO的生物学作用是促进巨核细胞的增殖、分化与成熟，促进血小板的产生，是血小板生成的最重要的调节因子。它还可加速原始造血干细胞进入细胞周期，促进其增殖，而对粒细胞集落和红细胞无明显影响(陈学良和宋丽，1998；隋杰和肖灿鹏，2002)。因此，促血小板生成素对于维持机体的正常凝血功能有着重要的意义，目前，重组人血小板生成素(rhTPO)已由沈阳三生开发生产并已上市，商品名特比澳，用于治疗放疗和化疗引发的血小板减少症。然而，美国在完成rhTPOI/II临床试验后发现它引起TPO中和性抗体的产生，这将导致继续使用无效甚至是进一步的血小板减少，因此中止了后续的临床试验。事实上，全球范围内rhTPO仅在中国上市(郭涛和刘丹，2011)。多种治疗肿瘤的化疗药物可引起骨髓抑抑制，导致病人血小板数量的减少，产生自发性出血，危及生命。尽管多种重组人细胞因子诸如：IL-1，IL-3，IL-6，IL-11均具有一定的促血小板增生作用，但大多会引起头痛、发热以及高血压等副作用(李越希等，2002)。TPO的生理功能的发挥是通过与靶细胞表面的TPO受体(c-mpl)的结合，引起了c-mpl的二聚体化，进而诱发细胞内一系列的蛋白质磷酸化，导致细胞内信号级联放大产生效应(汪治清和杨新科，1998)。对于TPO晶体结构的研究表明该分子具有两个受体结合位点，这使一分子TPO可以和两分子受体结合，进而引起的受体分子双体化(Feesedtal.，2004)。研究人员采用噬菌体展示库技术筛选与TPO非同源但高活性的模拟肽。这一多肽为14肽，它可选择性结合于TPO受体，尤其是当它形成二聚体后，其体外与受体的亲和活性与天然TPO相当(Cwirldtal.，1997)。由于TPO模拟肽分子量小，易于被肾小球滤除，因而它同其它分子量小的肽和蛋白类似，在体内应用后半衰期短，仅有几分钟。安进公司将这一模拟肽与抗体的Fc片段融合，开发的Nplate产品已于2008年8月上市，用于治疗原发性血小板减少症。该产品具有TPO活性，但由于同TPO不同源，避免了中和性抗体的产生，但是由于Fc片段为非惰性蛋白，Nplate因此带来了免疫负作用。为克服Nplate的缺陷，我国研究者因此将同一模拟肽二聚体与人血清白蛋白融合，用于延长TPO模拟肽的半衰期(CN201110420870.0)，该融合蛋白可促进Mo7e细胞增殖。但是，当我们将这一融合蛋白给正常小鼠皮下注射，未能检测到它促血小板生成活性，在原发性血小板减少症模型中也没有效果。综上所述，市场上正期待有更好表现的新一代促血小板生成的药物。本专利技术提供二聚体化促血小板生成素模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白的制备方法及应用。本专利技术在人血清白蛋白与促血小板生成素模拟肽TMP二联体间加入二聚体化结构域H，同时选择性加入fip结构域，经过改造的促血小板生成素模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白将在表达时二聚体化。我们克隆了改造后的融合蛋白基因，并将其连接入酵母或哺乳动物高效表达质粒，使重组融合蛋白在酵母或动物细胞中高效表达。表达产物经纯化后，正常小鼠皮下注射，可显著提升血小板数；皮下注射给予小鼠原发性和继发性血小板减少症模型，治疗效果显著。参考文献唱韶红，巩新，杨志愉，王同映，马国昌，马清钧，吴军.2006.人血清白蛋白和人干扰素α2b的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促血小板生成素模拟肽TMP二联体‑人血清白蛋白的二聚体化融合蛋白，所述的二聚体化融合蛋白包括促血小板生成素模拟肽TMP二联体、肽接头和人血清白蛋白HSA组成，其特征在于，该融合蛋白还含有二聚体化结构域。

【技术特征摘要】
1.一种促血小板生成素模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白的二聚体化融合蛋白，所述的二聚体化融合蛋白包括促血小板生成素模拟肽TMP二联体、肽接头和人血清白蛋白HSA，该融合蛋白还含有二聚体化结构域，所述二聚体化结构域位于TMP二联体和人血清白蛋白之间，其特征在于所述二聚体化结构域为肽段H，肽段H的基因序列如SeqIDNo：1所示，氨基酸序列如SeqIDNo：2所示。2.一种促血小板生成素模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白的二聚体化融合蛋白，所述的二聚体化融合蛋白包括促血小板生成素模拟肽TMP二联体、肽接头和人血清白蛋白HSA，该融合蛋白还含有二聚体化结构域，所述二聚体化结构域位于TMP二联体和人血清白蛋白之间，其特征在于所述二聚体化结构域为肽段H和选自fip结构域的肽段fip，肽段H的基因序列如SeqIDNo：1所示，氨基酸序列如SeqIDNo：2所示；选自fip结构域的肽段fip的基因序列如SeqIDNo：3所示，氨基酸序列如SeqIDNo：4所示。3.根据权利要求2所述的一种促血小板生成素模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白的二聚体化融合蛋白，其特征在于所述HSA可以连接于融合蛋白的N-末端，结构式表示为TMP-L-TMP-L5-H-fip-HSA，L和L5表示肽接头，L的基因序列为GGTGGCGGCTCCGGA、TCCGGA、GGTGGCCCCTCCGGA或GGCGGTGGCGGCAGCGGTGGCGGCTCCGGA，氨基酸序列为GGGSGH、SG、GGPSG或GGGGSGGGSG，H表示二聚体化结构域肽段，L5的核苷酸序列为GGCGGCGGCGGAAGCAGATCT，氨基酸序列为GGGGSRS，fip表示选自fip结构域的肽段。4.根据权利要求1所述的一种促血小板生成素模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白的二聚体化融合蛋白，其特征在于所述HSA可以连接于融合蛋白的C-末端，结构式表示为HSA-L6-H-L7...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62