【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的含异二聚体抗体Fe的蛋白比如双特异性抗体，及制备此类蛋白的新方法。
技术介绍
近年来单克隆抗体已成为成功的治疗分子，特别是用于治疗癌症。但是，不幸的是，当单克隆抗体用作单一疗法时，经常不能治愈疾病。双特异性抗体有可能克服单克隆抗体疗法的一些限制，如它们可用作介质以靶向药物或毒性化合物至靶细胞，用作介质以再靶向效应机制至疾病相关部位或用作介质以增加对肿瘤细胞的特异性，例如通过与只见于肿瘤细胞的靶分子的组合结合。最近关于双特异性抗体的不同形式和用途的综述见于Chames和Baty (2009)Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276。开发双特异性抗体的主要障碍之一是通过传统技术难以制备足够质量和数量的材料，所述传统技术比如杂交杂交瘤和化学缀合方法(Marvin和Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649)。由不同重链和轻链组成的两种抗体在宿主细胞中的共表达，除了产生期望的双特异性抗体以外，还产生可能的抗体产物的混合物。已描述数种策略以利于在不同抗体构建体共表达后形成异二聚的(即双特异性)产物。Lindhofer等(1995 J Immunol 155:219)已描述产生不同抗体的大鼠和小鼠杂交瘤的融合导致功能性双特异性抗体的富集，因为优先的物种限制性重/轻链配对。另一种促使形成异二聚体超过同二聚体的策略是“进入孔中的隆突(knob-1nto-hole)”策略，其中在第一重链多肽的界面引入隆起，在第二重链多肽的界面引入对应的腔，使得隆起可位于腔内，以便促使异二聚 体形成和阻碍同二聚体形成。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.20 DK PA201000330;2010.11.24 DK 201001066;1.一种用于产生异二聚体蛋白的体外方法，所述方法包含以下步骤: a)提供包含免疫球蛋白Fe区的第一同二聚体蛋白，所述Fe区包含第一CH3区， b)提供包含免疫球蛋白Fe区的第二同二聚体蛋白，所述Fe区包含第二CH3区， 其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用， c)在足以允许铰链区的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一蛋白与所述第二蛋白一起孵育，和 d)获得所述异二聚体蛋白。2.权利要求1的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白和所述第二同二聚体蛋白选自⑴Fe区，(ii)抗体，(iii)包含Fe区的融合蛋白，和(iv)与前药、肽、药物或毒素缀合的Fe区。3.权利要求1的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白是全长抗体。4.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第二同二聚体蛋白是全长抗体。5.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二同二聚体蛋白都是抗体且结合不同的表位。6.述权利要求中任一项的体外方法，其中第一同二聚体蛋白的Fe区是选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同 种型的，其中第二同二聚体蛋白的Fe区是选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同种型的。7.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和所述第二同二聚体蛋白两者的Fe区都是IgGl同种型的。8.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述同二聚体蛋白的一个Fe区是IgGl同种型的，另一个是IgG4同种型的。9.述权利要求中任一项的体外方法，其中与每种同二聚体相互作用相比的异二聚体相互作用强度增加是因为CH3修饰，而非因为引入共价键、半胱氨酸残基或荷电残基。10.述权利要求中任一项的体外方法，其中在所得异二聚体蛋白中所述第一蛋白与第二蛋白之间的异二聚体相互作用使得在实施例13描述的条件下在0.5 mM GSH下不会发生Fab臂互换。11.述权利要求中任一项的体外方法，其中在所得异二聚体蛋白中所述第一蛋白与第二蛋白之间的异二聚体相互作用使得在实施例14描述的条件下在小鼠体内不会发生Fab臂互换。12.述权利要求中任一项的体外方法，其中例如按照实施例30所述测定时，在所得异二聚体蛋白中所述第一蛋白与第二蛋白之间的异二聚体相互作用强度为两种同二聚体相互作用中的最强相互作用强度的大于2倍，例如大于3倍，例如大于5倍。13.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二CH3区的序列使得当按照实施例30所述测定时，在所得异二聚体蛋白中所述第一蛋白与第二蛋白之间异二聚体相互作用的解离常数低于0.05微摩尔。14.述权利要求中任一 项的体外方法，其中所述第一和第二CH3区的序列使得当按照实施例21所述测定时，两种同二聚体相互作用的解离常数都高于0.01微摩尔，比如高于,0.05微摩尔，优选0.01-10微摩尔，比如0.05-10微摩尔，更优选0.01-5,比如0.05-5微摩尔，甚至更优选0.01-1微摩尔，比如0.05-1微摩尔，0.01-0.5或者0.01-0.1微摩尔。15.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二CH3区的序列在不同的位置含有氨基酸取代。16.权利要求15的体外方法，其中氨基酸取代基是天然氨基酸或非天然氨基酸。17.述权利要求中任一项的体外方法，其中与野生型CH3区相比，所述第一同二聚体蛋白在CH3区具有不超过I个氨基酸取代，第二同二聚体蛋白在CH3区具有不超过I个氨基酸取代。18.述权利要求1至16中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405、407和409，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405、407和409，其中所述第一同二聚体蛋白和所述第二同二聚体蛋白不在相同位置取代。19.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405 和 407。20.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在405位具有非Phe的氨基酸。21.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在405位具有非Phe、Arg或Gly的氨基酸。22.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在405位的Phe和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白包含在405位的非Phe的氨基酸和在409位的Lys。23.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在405位的Phe和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白包含在405位的非Phe、Arg或Gly的氨基酸和在409位的Lys。24.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在405位的Phe和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白包含在405位的Leu和在409位的Lys。25.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在405位的Phe和在409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含在405位的非Phe、Arg或Gly的氨基酸和在409位的Lys。26.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在405位的Phe和在409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含在405位的Leu和在409位的Lys027.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu。28.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu ο29.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在370位的Lys、在405位的Phe和在409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu。30.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸,所述第二同二聚体蛋白在407位具有非Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser 或 Thr 的氨基酸。31.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在407位具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val 或 Trp032.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基 酸,所述第二同二聚体蛋白在407位具有Gly、Leu、Met、Asn或 Trp033.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白具有在407位的非 Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser 或 Thr 的氨基酸和在 409 位的 Lys。34.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白具有在407位的 Ala、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Val 或 Trp 和在 409 位的 Lys。35.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白具有在407位的 Gly、Leu、Met、Asn 或 Trp 和在 409 位的 Lys。36.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的Arg,所述第二同二聚体蛋白具有在407位的非Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser 或 Thr 的氨基酸和在 409 位的 Lys。37.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白具有在407位的Ala、Gly、His、He、Leu、Met、Asn、Val 或 Trp 和在 409 位的 Lys。38.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的Arg,所述第二同二聚体蛋白具有在407位的Gly、Leu、Met、Asn或Trp和在409位的Lys。39.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，第二同二聚体蛋白具有: ⑴在368位的非Phe、Leu和Met的氨基酸，或者 (ii)在370位的Trp，或者 (iii)在399位的非Asp、Cys>Pro、G...
【专利技术属性】
技术研发人员：AF拉布里恩，J米斯特斯，Evd布雷默，JJ内杰森，Pv伯克尔，Bd戈伊杰，T文克，J范德温克尔，J舒尔曼，P帕伦，
申请(专利权)人：根马布股份公司，
类型：
国别省市：
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