高效诱导抗体重链恒定区的异源二聚体形成的CH3域变体对，其制备方法及用途技术

本发明专利技术涉及一种抗体的CH3域变体对，其制备方法及用途，其中在该CH3域中诱导突变，以提高抗体异源二聚体重链恒定区的形成产率。本发明专利技术的CH3域异源二聚体以90-95％或以上的高效率形成异源二聚体重链恒定区，且其还具有优异的热稳定性。包括CH3域异源二聚体的异源二聚体重链恒定区可构建同时识别两种抗原的双特异性单克隆抗体。本发明专利技术的CH3域异源二聚体和包含其的双特异性抗体或抗体恒定区融合蛋白可有利地用于治疗或预防与靶抗原或靶蛋白有关的疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于提高抗体（免疫球蛋白G，IgG)的重链恒定区的异源二聚体的形 成产率的诱导CH3域突变的CH3域变体对，使用该CH3突变对的异源二聚体Fc对蛋白，双 特异性抗体以及融合蛋白。 本专利技术还涉及一种药物组合物，其包括异源二聚体、具有异源二聚体的异源二聚 体Fc对、双特异性抗体以及融合蛋白。 本专利技术还涉及制备CH3域变体对的方法和其中优选形成抗体CH3域异源二聚体Fc 的异源二聚体Fc对蛋白。
技术介绍
在19世纪后期，发现了这样的事实，即当对其它动物施用已施用了非致死剂量的 白喉和破伤风的实验动物的血清时，可以预防白喉和破伤风。在此发现之后，人们逐渐开始 在临床上采用血清治疗即抗体治疗的概念。然而，由于存在获得高纯度抗体和血源性感染 剂易污染的问题，早期抗体治疗的可行性非常有限。为了解决传统抗体治疗中的这类问题， 根据1975年研发的杂种细胞融合技术以相对低的成本大规模生产了纯形式的啮齿动物源 单克隆抗体。然而，由于存在一些问题和副作用如半衰期短、对抗鼠抗体有免疫应答、疗效 降低以及当对人体施用小鼠源单克隆抗体时有致命过敏反应，其临床应用受到限制。 由于20世纪80年代生物技术革命的起点即基因重组技术的出现，可以制备其中 小鼠单克隆抗体通过基本操作而人源化的人源化抗体；使对患者施用所述抗体时引起的各 种免疫学副作用最小化；并且建立了治疗抗体的有效临床应用的基础。同时，从20世纪90 年代中期起已研发了这样的基本技术，使用该基本技术借助噬菌体展示技术或转基因鼠可 以生产完全人类单克隆抗体。目前，对于使用抗体研发新药，许多国内外制药公司踊跃进行 了大量研宄和投资。如今，美国食品和药物管理局（FDA)批准了约26种全球性市售新抗体 药物，并且300种或以上的治疗抗体正在临床试验阶段，这表明了抗体在制药工业中的重 要性。同时，最近已报道了，临床前和临床试验结果显示：当将有靶向选择性的抗体和没有 靶向特异性的化学治疗剂共同施用时，抑制了副作用并改善了治疗效果。因此，抗体的有用 性将在抗癌症治疗中进一步提尚的。 同时，目前正研发主要用于癌症和自体免疫疾病的新抗体药物。具体而言，IgG或 全抗体形式的新抗体药物没有展现出令人满意的实体瘤治疗效果，且高抗体生产成本可能 是研发新抗体药物的障碍。因此，已不断尝试研发比相关领域中的抗体有更加改善的生物 效应的重组蛋白形式的新抗体药物。其中一种是其中一个抗体可与至少两个靶分子结合的 双特异性抗体，对其的研宄自20世纪80年代中期已开始了，，特别是使用该抗体用于抗癌 治疗。 天然抗体（免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgD、IgE和IgA)具有其中将具有相同氨基 酸序列的两条重链和有相同序列的两条轻链组装的形式。在这种情况中，通过抗体恒定区 (Fc，可结晶片段）的最终域（即，IgG中的CH3域、IgM中的CH4域、IgD中的CH3域、IgE中 的CH2和CH4域以及IgA中的CH3域）之间的相互作用诱导相同两条重链的同源二聚体的 形成。然后，诱导铰链区之间的二硫键，并形成强健（robust)重链之间的同源二聚体。特 别地，通过重链绞链区中第五位Cys和κ轻链中第107位Cys之间的二硫键诱导人类IgGl 中的重链和轻链的组装。 因此，天然单克隆抗体（mAb)具有与一种抗原二价结合的特性。另一方面，双特异 性抗体指的是可同时或择一地与两种抗原结合的单分子形式的抗体。这种双特异性抗体在 相关领域中被称为操控蛋白（manipulated protein)，如可与两种或多种抗原结合的双特 异性或多特异性抗体，并且可以使用细胞融合、化学键合和重组DNA技术来制备。 在相关领域中，使用细胞杂交瘤技术制备双特异性抗体，该细胞杂交瘤技术中， 使用表达有所需特异性的小鼠单克隆抗体的两种不同细胞杂交瘤细胞系的体细胞融合 (Milstein和Cuello, 1983)。在这种情况中，两条不同的轻链在细胞杂交瘤细胞系中任意 配对，以生成最多10种类型的各种抗体，并且很难从该抗体混合物中分离并纯化所需的双 特异性抗体。因此，复合纯化方法对只获得所需的双特异性抗体是必要的，因为存在形成错 误配对的副产物且生产良率降低（Morrison，2007)。 作为解决这些问题的方法，一种双特异性抗体形式被研发了出来，其中轻链和重 链的抗原结合位点片段通过多条链连接并在单构建体中表达。这种形式包括单链双体、串 联单链片段可变（scFv)抗体等的形式（Holliger和Hudson，2005)。而且，制备了额外抗 原结合抗体片段融合到形式与Ig相似的抗体重链或轻链的N-端或C-端的双特异性抗体 (Miller, Meng et al. 2003 ;Lu，Zhang et al. 2004)〇 toon] 然而，基于这种抗体片段组装的双特异性抗体具有以下问题，由于稳定性低而导 致表达水平降低，形成抗体聚集，并因此提高了致免疫性（Chan和Carter，2010)。而且，仅 基于抗体片段组装的双特异性抗体没有抗体重链恒定区（Fe)。因此，存在没有以下特性的 问题：随Fc提高的稳定性、取决于大小增加和与Fc受体（新生儿Fc受体，FcRn)结合的长 血清半衰期、纯化工序中结合位点（蛋白A和蛋白G)保留的优点、抗体依赖性细胞毒性以 及补体依赖性细胞毒性（Chan和Carter，2010)。 因此理想地，有必要研发结构与天然存在的抗体（IgG，IgM，IgA，IgD和IgE)非常 相似且与其有最小序列偏差的双特异性抗体。 为了解决上述问题，曾尝试使用结进孔（knob-into-hole)技术来研发双特异性 抗体。该技术中，通过基因操作，在两条不同的Ig重链的CH3域中引入突变，在一条Ig重 链的CH3域中制作孔结构，在另一条Ig重链的CH3域中制作结结构，并诱导两条Ig重链以 形成异源二聚体（美国专利号7695936B2 ;韩国专利申请号10-2010-0087394)。在这种情 况中，根据抗体链的氨基酸数目的EU编号，有助于人类Ig重链CH3域之间同源二聚体形成 的疏水核心中包含的氨基酸残基是Leu351、Thr366、Leu368和Tyr407 (Cunningham, Pflumm et al. 1969)。结进孔技术中，据报道，关于位于CH3域界面中疏水核心的残基，在一条重 链CH3域中制作孔结构，以致具有大侧链的疏水氨基酸残基被具有小侧链的疏水氨基酸 (Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val)替换，在另一条重链CH3域中制作结结构，以致具有 小侧链的疏水氨基酸残基被具有大侧链的氨基酸残基（Thr366Trp)替换，以及当两种突变 对，即引入了 CH3A(Thr366Ser、Leu368Ala 和 Tyr407Val)和 CH3B(Thr366Trp)的重链恒定 区突变对被共表达时，优选异源二聚体Fe的形成多于同源二聚体的形成（Ridgway, Presta et al. 1996)。然而，结进孔技术中，据报道，异源二聚体Fe(异源二聚体的异源二聚体Fe) 的形成产率为约80% (Ridgway, Presta et al. 1996)。为了促进异源二聚体的稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含抗体CH3域的异源二聚体，其包括以下结合(a)：(a)在选自Tyr349、Asp356、Glu357、Ser364、Lys370、Lys392、Asp399、Phe405和Lys409的第一组CH3域中，i)氨基酸与ii)氨基酸之间结合，所述i)氨基酸选自丙氨酸(A)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)、蛋氨酸(M)和甘氨酸(G)，其在所述第一组的至少一个位置被替换，所述ii)氨基酸选自苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)，且在所述第一组的至少一个位置被替换(其中，所述位置根据EU指数编号)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：金容星，崔慧智，成恩实，
申请(专利权)人：亚洲大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR