The invention reduces a method for amplifying a primer two in a multiplex polymerase chain reaction (PCR). When the first forward primer (F1) and the second reverse primer (R2) have complementary regions at their 3 'ends, a primer two dimer can be formed. The method of the present invention uses a primer (F1^) of a 5 'end part sequence or a full-length sequence containing a first forward primer between a first tag (T1) and a R2 to reduce the amplification of a primer two (F1_R2).
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】减少引物二聚体扩增的方法
本专利技术涉及在多重聚合酶链式反应(PCR)中减少引物二聚体扩增的方法。专利技术背景多重PCR由单个PCR混合物中的多个引物组组成,从而生成对不同DNA序列特异的扩增子。通过一次性靶向多个基因,可由单个测试轮次获得额外信息,否则需要若干倍的试剂和努力才能完成。降低多重PCR测定灵敏度的主要障碍之一是引物二聚体(PD)的累积。PD由彼此杂交的引物分子组成,杂交的原因是成串的互补碱基,特别是在引物的3’端。多重PCR反应中极高浓度下许多引物对的存在提高了引物二聚体形成的机会。一旦形成,短的PD倾向于非常有效地扩增,通过大量消耗引物和其他试剂潜在地抑制所需DNA序列的扩增。可通过不同方法的组合来减少PD形成,包括特别的引物设计和修饰方法、使用热启动Taq聚合酶、PCR添加剂和优化的PCR循环条件。已报道多种用于减少PD形成的引物设计和修饰方法。Brownie等(NucleicAcidsRes,25(16):3235-41,1997)描述了HANDS(同源标签辅助的无二聚体系统)。在HANDSPCR中,所有靶标特异性引物都在低浓度下在其5’端含有共有的尾部序列并在较高浓度下与单个尾部特异性引物混合。在至少两个循环的靶标特异性PCR后,对完全由尾部特异性引物驱动的后续扩增循环提高退火温度。结果是,来自所有PCR产物的单链(包括所需的扩增子和副产物如PD)都具有互补的5’和3’端,其导致形成相同的茎环结构。由于尾部序列的高局部浓度,短产物如PD中形成的茎环结构非常稳定且稳定程度超过尾部特异性引物的后续退火,导致PD扩增的抑制。然而,在所有 ...
【技术保护点】
一种减少多重聚合酶链式反应(PCR)中引物二聚体扩增的方法,包括以下步骤:(a)获得第一核酸序列,所述第一核酸序列包含第一标签(t1)和与第一靶核酸片段互补的第一正向引物(F1),(b)获得第二核酸序列,所述第二核酸序列包含第二标签(t2)和与所述第一靶核酸片段互补的第一反向引物(R1),(c)获得第三核酸序列,所述第三核酸序列包含第三标签(t3)和与第二靶核酸片段互补的第二正向引物(F2),(d)获得第四核酸序列,所述第四核酸序列包含所述第一标签(t1)、与所述第二靶核酸片段互补的第二反向引物(R2)以及所述第一标签(t1)与所述第二反向引物(R2)之间的所述第一正向引物的5’端部分序列或全长序列(F1^),其中所述第一正向引物(F1)和所述第二反向引物(R2)在其3’端具有互补区域,(e)混合所述第一和第二靶核酸片段、所述第一、第二、第三和第四核酸序列以及有效量的进行聚合酶链式反应(PCR)必需的试剂;以及(f)进行PCR。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.07 US 62/189,6861.一种减少多重聚合酶链式反应(PCR)中引物二聚体扩增的方法,包括以下步骤:(a)获得第一核酸序列,所述第一核酸序列包含第一标签(t1)和与第一靶核酸片段互补的第一正向引物(F1),(b)获得第二核酸序列,所述第二核酸序列包含第二标签(t2)和与所述第一靶核酸片段互补的第一反向引物(R1),(c)获得第三核酸序列,所述第三核酸序列包含第三标签(t3)和与第二靶核酸片段互补的第二正向引物(F2),(d)获得第四核酸序列,所述第四核酸序列包含所述第一标签(t1)、与所述第二靶核酸片段互补的第二反向引物(R2)以及所述第一标签(t1)与所述第二反向引物(R2)之间的所述第一正向引物的5’端部分序列或全长序列(F1^),其中所述第一正向引物(F1)和所述第二反向引物(R2)在其3’端具有互补区域,(e)混合所述第一和第二靶核酸片段、所述第一、第二、第三和第四核酸序列以及有效量的进行聚合酶链式反应(...
【专利技术属性】
技术研发人员:王朝晖,宋钢,
申请(专利权)人:上海真固生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:上海,31
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