一对部分同序引物减少其二聚体的方法技术

本发明专利技术“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，根据发明专利技术人的发现－没有连续互补碱基的引物对沿５’－３’方向平行配对形成多处间隔氢键的合力促使它们３’末端个别互补碱基形成氢键使末端结合延伸成二聚体；和单一引物自身不形成二聚体的现象。尽最大比例设计ＰＣＲ引物对近似单一引物。其特征在于ＰＣＲ引物对中间沿５’－３’方向预设一段４－１０ｂｓａｅ同样序列，所述引物对３’末端１－５ｂａｓｅ避免间隔互补碱基，所述５’端区避免３个以上的间隔互补碱基，最好５’端完全同序。可极大减少引物二聚体形成，优化ＰＣＲ质量，尤其是荧光染料实时ＰＣＲ。

【技术实现步骤摘要】
一对部分同序引物减少其二聚体的方法
：本专利技术属于分子生物学技术及核酸扩增PCR
，具体涉及一种减少引物二聚体形成的引物设计方法。
技术介绍
：核酸研究从确立遗传物质基础为核糖核酸DNA起，历经半个多世纪的探索，到1953年Watson和Crick建立了DNA双螺旋结构模型及阐明了其中心法则，从而开启了核酸研究的分子生物学时代。由于各种核酸DNA都是由四种碱基排列组成的仅编码遗传信息不同的线性结构，其物理化学性能基本一样，难以通过一般理化技术分离纯化微量目的基因或特异性检测微量靶基因。二十世纪70、80年代美国冷泉港(ColdSpringHarber)实验室开发出了完整系统的基于细菌单克隆筛选基因文库及转化基因的分子克隆技术，然而要得到目的基因仍是费时、繁琐的工作。检测靶基因只能通过合成探针经印迹杂交(DotBlotting)才能检测纳克(ng)级的分子，且定量不准确，操作繁琐。早在1971年，Korana就提出了核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的KaryMullis偶然的产生了核酸扩增的灵感：于试管中模拟天然的DNA体内复制过程。提供一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。核酸扩增PCR反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：拟扩增的模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至54℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：升温至72℃左右，DNA模板--引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，不断重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～3分钟，2～3小时就能将待扩目的基因呈指数扩增放大百万倍以上。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100％，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”--平台期。Mullis经过一系列研究证实了这一技术，申请了首个PCR专利技术专利(USPatent4,683,202)。随着ABI-PE等公司开发出各种热循环PCR仪，包括最初的水浴锅式，以及压缩机制冷式和目前广泛应用的半导体制冷式PCR仪。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到Taq耐热DNA聚合酶以及pfu、Vent、Tth等其它耐热聚合酶的发现应用，PCR技术逐渐成熟、实用，并因其高灵敏度、操作简便而快速传播全世界，因而1989年称为“PCR爆炸年”。在以后的二十年里，多达数十种PCR新改进，新方法不断涌现，被专利技术，包括反转录PCR(RT-PCR)，原位PCR，连接酶链反应(Ligasechainreaction，LCR)，标记PCR(Labeledprimers，LP-PCR)，反向PCR(reversePCR，扩增两引物外侧未知序列)，不对称PCR(asymmetricPCR)，降落PCR(touchdownPCR)，重组PCR(recombinantPCR)，巢式PCR(nestPCR)，多重PCR(multiplexPCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA差异PCR，链替换扩增(Stranddisplacementamplification，SDA)，依赖核酸序列的扩增(Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)，转录依赖的扩增系统(Transcript-basedamplificationsystem，TAS)，Qβ复制酶(Q-betareplicase)催化RNA扩增，滚环扩增(Rollingcircleamplification，RCA)，环介导的等温扩增(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)等，尤其是近年来各种实时荧光PCR(Real-timePCR)技术的发展实现了从定性测定到精确定量的飞跃，如荧光染料SYBRGreenI实时荧光PCR和各种荧光探针Taqman(Hydrolysisprobe)，FRETHybriditionprobes，andMolecularBeaconsPCR，详见综述(MaisaL.WongandJuanF.Medrano，BioTechniques39：75-85，July2005)。实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物量(荧光强度)与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物荧光信号达到对数期的循环数Ct值(Cyclethreshold)与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数(Ct)。核酸扩增技术极大提高了基因克隆效率及核酸检测灵敏度、效率，PCR应用已拓展到生物学的许多领域。PCR技术已不是单一技术方法，而是包括一系列理论、方法学及应用的新学科。详细综述于PCR书籍(黄留玉等“PCR最新技术原理、方法及应用”化学工业出版社2005年)，PCR广泛应用于分子克隆、测序、基因重组、蛋白质工程等生命科学研究，及医疗、农林、畜牧、环保、食品等众多检测应用领域，成为现代分子生物学最核心的基础技术。截至目前全世界与PCR相关的专利已多达数千个以上。所有这些核酸扩增PCR技术的质量控制及实验条件优化的核心、关键主要在于其扩增引物的质控及设计。引物对的特异性(尤其3’端)长度、GC含量、退火及融解温度、稳定性、同源互补性及二级结构等等就决定了PCR产物扩增的特异性、产物的有无、本底背景大小、检测灵敏度、是否可定量以及可重复性等等。关于引物的设计工作，现有许多商业引物设计软件如PRIDE、PRIME+、DOPRIMER、PRIMO、MEDUSA和PrimerMaster等，也有更多的在线引物设计网址可供应用选择，如Primer3……等等，详见综述(F.JohnBurpo，Biochemistry218：1-11，Aug2001和VinayK.Singh&AnilKumar，MolecularBiologyToday2(2)：27-32，2001)。然而这些生物信息软件只解决了以上这些一般性优化条件，采用这些原则应用软件设计的没有连续互补序列的引物对，在特异性、长度、GC含量、退火温度Tm值及二级结构上最优化本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，其特征是设计ＰＣＲ的一对扩增引物最基本原则是尽最大比例的近似单一引物。所述ＰＣＲ引物对中间区域沿５’－３’方向设置一段４－１０ＢＡＳＥ同样序列以分散引物链多处间隔互补碱基所形成氢键的合力；所述引物３’末端预留１－５ｂａｓｅ，其一３’最末端与另一条３’末端最后两个碱基绝对避免互补，也要避免有间隔的碱基互补。所述中间部分同序引物对５’端区域沿５’－３’方向平行比对，不要有３个以上间隔碱基互补，从而优化ＰＣＲ质量。

【技术特征摘要】
1.一对部分同序引物减少其二聚体的方法，其特征是选取PCR扩增引物对的基本原则是以部分同序引物模拟或近似单一引物，所述PCR引物对中间区域沿5’-3’方向选用一段4-10碱基同样序列以分散引物链多处间隔互补碱基所形成氢键的合力；所述引物3’末端预留1-5碱基，其一3’最末端与另一条3’末端最后两个碱基绝对避免互补，也要避免有间隔的碱基互补；所述中间部份同序引物对5’端区域沿5’-3’方向平行比对，不要有3个以上间隔碱基互补；从而减少PCR应用上的非特异性。2.根据权利要求1所述的一对部分同序引物减少其二聚体的方法，其PCR引物对共同特征是：首先遵守一般引物设计所有原则，选择一对16～24碱基长的优化引物对，在其中间位置，从5’-3’方向平行比对选一段4～10碱基完全相同的序列；引物对相同序列碱基下游尾端离引物3’最末端为1～5个碱基靶特异序列，也避免不连续的单个互补碱基，且单个互补碱基还不要留在引物3’最末端；引物对相同序列碱基首端离引物5’最末端一般为4～10个碱基序列，选择较少的不连续的单个互补，最多只允许间隔的3对不连续互补碱基。3.根据权利要求2所述的一对部分同序引物减少其二聚体的方法，其PCR引物对共同特征是：首先遵守一般引物设计所有原则，选择一对16～24碱基长的优化引物对，在其中间位置，从5’-3’方向平行比对选一段6～8碱基完全相同的序列；引物对相同序列碱基下游尾端离引物3’最末端为2～4个碱基靶特异序列，也尽量避免不连续的单个互补碱基，且单个互补碱基还不能留在引物3’最末端；引物对相同序列碱基首端离引物5’最末端一般为6～8个碱基序列；如此一组系列...

【专利技术属性】
技术研发人员：江洪，张宝林，江必胜，刘涛，张辉，
申请(专利权)人：北京泰格瑞分子检验有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]