一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术属于微生物检测领域，尤其涉及一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物及试剂盒。引物根据肺炎支原体P1基因的特异性保守靶序列设计的,引物由四条引物组成，包括前端内引物SIP，后端内引物ASIP，和外引物S和AS；所述的一对外引物S和AS，其中S引物位于SIP上游，AS引物位于ASIP下游。本发明专利技术可用于肺炎支原体肺炎的快速检测，为临床早期诊断和治疗提供保证，实现了快速、准确、便捷及低成本检测的重要价值。

Rolling ring constant temperature amplification fast primer and kit for Mycoplasma pneumoniae

The invention belongs to the field of microbial detection, in particular to a rolling ring constant temperature amplification fast primer and a reagent box for Mycoplasma pneumoniae. Specific primers according to the Conservative MP P1 gene target sequence design primer, by four primers, including front-end inner primers SIP, ASIP and rear inner primers, primers S and AS primers; a foreign S and the AS, the S primers were located upstream of SIP, AS primers located downstream of ASIP. The invention can be used for rapid detection of Mycoplasma pneumoniae pneumonia, and provides a guarantee for early diagnosis and treatment of the disease, and realizes the important value of fast, accurate, convenient and low cost detection.

【技术实现步骤摘要】
一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物及试剂盒
本专利技术属于微生物检测领域，尤其涉及一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物及试剂盒。
技术介绍
肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，Mp)是呼吸道感染最常见的致病菌之一。我国流行病学调查显示，Mp已成为我国成人社区获得性肺炎的首要致病菌。Mp感染不但可引起呼吸道疾病，还可引起全身多器官病变，如脑炎、心肌炎、肝炎、肾炎、免疫溶血性贫血等，而且近些年来Mp引起的危重病例不断增多。由于Mp缺乏细胞壁，对常用抗生素如β-内酰胺类等药物的治疗，效果不明显。现有医学领域对Mp的检测手段为：肺炎支原体培养、肺炎支原体核酸PCR扩增和血清学检测（lgM和lgG），这些方法耗时长、需要特殊的仪器、并且成本高。因此，亟需研究一种可以快速、准确的判断出Mp感染的方法，然后合理并具有针对性的选择抗生素进行临床治疗，及时控制感染。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种肺炎支原体滚环恒温扩增快速检测引物及试剂盒，利用滚环恒温扩增（RCA）技术可进行菌样的快速、高准确度检测。为了实现上述目的，本专利技术提供一种用于检测肺炎支原体的引物，是根据肺炎支原体P1基因的特异性保守靶序列设计的，所述引物由四条引物组成，包括前端内引物SIP，后端内引物ASIP，外引物S和AS；其中S引物位于SIP上游，AS引物位于ASIP下游；在带有链置换功能的BstDNA聚合酶作用下，四条引物以肺炎支原体基因组DNA为模板，扩增出一条单链DNA目标模板。单链DNA目标模板在桥引物BP的帮助下，被DNA连接酶连接环化，通过与环化DNA目标模板互补的桥引物BP，启动肺炎支原体基因组DNA滚环复制，每一轮滚环复制的产物又可以被DNA连接酶连接环化，产生级联放大的循环扩增。所述的肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物的核苷酸序列如下。外引物S：SEQIDNO：2：CGCTGCGCCACACCAATG。外引物AS：SEQIDNO：3：AGCGGCTTTGACCGCATC。内引物SIP：SEQIDNO：4：TGAATCCGTTAGTTTTTCTCCCGCTCTCCCAACCCGCGCTTAACCCCGTG。内引物ASIP：SEQIDNO：5：AATAAGGAGGCGGCTGCTGGTCGGGTGGGATCATACGTGGT。桥式引物BP：SEQIDNO：6：CTAACGGATTCAAATAAGGAGG。为实现上述目的，本专利技术还提供一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下组分：10×BstDNA聚合酶缓冲液（NEB）；MgSO4(100mM)；10×DNA连接酶缓冲液（Thermo）；dNTP(10mMeach)；外引物S（10µM）；外引物AS（10µM）；内引物SIP（10µM）；内引物ASIP（10µM）；桥式引物BP（10µM）；肺炎支原体基因组DNA（10ng/µl）；BstDNA聚合酶大片段(NEB，1600U/mL)；DNA连接酶(Thermo，1000U/mL)；25×钙黄绿素指示剂（钙黄绿素625µM、MnCl210mM）和水。上述试剂盒应用于临床样品肺炎支原体检测，其使用方法依次包括如下步骤。1、提取肺炎支原体的基因组DNA。2、按试剂盒配方，制作肺炎支原体滚环扩增检测反应体系。3、反应结束后进行结果判定：在反应液中加入钙黄绿素指示剂（终浓度25µM钙黄绿素和400µMMnCl2），颜色变为绿色，表示待测样品中存在肺炎支原体（结果阳性），颜色不变，表示待测样品中不存在肺炎支原体（结果阴性）。所述的提取肺炎支原体的基因组DNA的OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10ng/μL-100ng/μL范围内。所述的提取肺炎支原体的基因组DNA的OD260/OD280优选1.8。本专利技术的有益效果。滚环扩增（rollingcircleamplification，RCA）是最新发展起来的一种恒温核酸扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物，在酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。因此，本专利技术所提供的检测试剂盒针对肺炎支原体，采用了用于滚环恒温扩增反应的特异性引物，该试剂盒检测Mp的方法具有以下优势：（1）通过4条引物的6个特异性区域，对检测靶序列进行特异性识别，实现很好的检测特异性；（2）通过桥引物使检测靶序列环化，与AIP/ASIP引物共同实现靶序列级联扩增的信号放大效果，灵敏度高；（3）反应过程只需要65摄氏度的恒温进行即可，简单易用，操作方便。本专利技术检测试剂盒中的序列是通过大量的实验设计出来的新基因序列，在现有的基因库中并未公开。同时，桥式引物BP可以将AIP/ASIP引物合成的产物连接环化，对形成级联扩增具有重要作用。本专利技术可以用于肺炎支原体肺炎的快速检测，为临床的早期诊断和治疗提供保证，实现了快速、准确、便捷及低成本检测的重要价值。目前，国内未见有用于检测肺炎支原体的滚环扩增检测试剂盒及其专用引物。具体实施方式下列结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1。对肺炎支原体标准菌株（ATCC15531）的检测从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得肺炎支原体P1基因(GenBank号：CP002077.1)，通过BLAST软件进行同源性分析，获得肺炎支原体P1基因的特异性保守靶序列SEQIDNO：1：TCGCGCTGCGCCACACCAATGCCATCAACCCGCGCTTAACCCCGTGAACGTATCGTAACACGAGCTTTTCCTCCCTCCCCCTCACGGGTGAAAATCCCGGGGCGTGGGCCTTAGTGCGCGACAACAGCGCTAAGGGCATCACTGCCGGCAGTGGCAGTCAACAAACCACGTATGATCCCACCCGAACCGAAGCGGCTTTGACCGCATCAA。根据该保守靶序列设计（可以找到对应的序列，通过与靶序列比对设计）滚环扩增引物：外引物S：SEQIDNO:2：CGCTGCGCCACACCAATG；外引物AS:SEQIDNO:3：AGCGGCTTTGACCGCATC；内引物SIP：SEQIDNO:4:TGAATCCGTTAGTTTTTCTCCCGCTCTCCCAACCCGCGCTTAACCCCGTG；内引物ASIP：SEQIDNO:5:AATAAGGAGGCGGCTGCTGGTCGGGTGGGATCATACGTGGT。；桥式引物BP：SEQIDNO:6:CTAACGGATTCAAATAAGGAGG。上述肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下组分：10×BstDNA聚合酶缓冲液(200mMTris-HCl、100mM(NH4)2SO4、100mMKCl、20mMMgSO4、1%Triton®X-100)；MgSO4(100mM)；10×DNA连接酶缓冲液（400mMTris-HCl、100mMMgCl2、100mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物，其特征在于，所述的引物根据肺炎支原体P1基因的特异性保守靶序列设计的,所述引物包括四条引物，前端内引物SIP，后端内引物ASIP，外引物S或AS；所述的一对外引物S和AS，其中S引物位于ASIP上游，AS引物位于SIP下游；各引物的核苷酸序列如下：外引物S：SEQ ID NO：2： CGC TGC GCC ACA CCA ATG；外引物AS：SEQ ID NO：3： AGC GGC TTT GAC CGC ATC；内引物SIP：SEQ ID NO：4：TGA ATC CGT TAG TTT TTC TCC CGC TCT CCC AAC CCG CGC TTA ACC CCG TG；内引物ASIP：SEQ ID NO：5：AAT AAG GAG GCG GCT GCT GGT CGG GTG GGA TCA TAC GTG GT；还包括一个桥式引物，核苷酸序列如下：桥式引物BP：SEQ ID NO：6：CTA ACG GAT TCA AAT AAG GAGG。

【技术特征摘要】
1.一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物，其特征在于，所述的引物根据肺炎支原体P1基因的特异性保守靶序列设计的,所述引物包括四条引物，前端内引物SIP，后端内引物ASIP，外引物S或AS；所述的一对外引物S和AS，其中S引物位于ASIP上游，AS引物位于SIP下游；各引物的核苷酸序列如下：外引物S：SEQIDNO：2：CGCTGCGCCACACCAATG；外引物AS：SEQIDNO：3：AGCGGCTTTGACCGCATC；内引物SIP：SEQIDNO：4：TGAATCCGTTAGTTTTTCTCCCGCTCTCCCAACCCGCGCTTAACCCCGTG；内引物ASIP：SEQIDNO：5：AATAAGGAGGCGGCTGCTGGTCGGGTGGGATCATACGTGGT；还包括一个桥式引物，核苷酸序列如下：桥式引物BP：SEQIDNO：6：CTAACGGATTCAAATAAGGAGG。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，可以用于检测肺炎支原体。3.如权利要求1所述用于检测肺炎支原体的引物制作的试剂盒，其特征在于，试剂盒配方中组份包括权利要求1所述的4个引物、BstDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、连接酶缓冲液、肺炎支原体基因组DNA、DNA连接酶、Bst聚合酶大片段、钙黄绿素指示剂和水。4.如权利要求3所述用于检测肺炎支原体的引物制作的试剂盒，其特征在于，所述的检测方法包括如下步骤：（1）提取肺炎支原体的的基因组DNA；（2）按试剂盒配方制作肺炎支原体滚环扩增检测反应体系；（3）反应结束后进行结果判定：在反应液中加入钙黄绿素指示剂，颜色变为绿色表示待测样品中存在肺炎支原体，表示...

【专利技术属性】
技术研发人员：李祝华，黄雪莹，宋建英，高占岩，吕辉，宋佳美，孙秒，
申请(专利权)人：沈阳优宁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21