一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物和扩增方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物和扩增方法及其应用。本发明专利技术分别以六对引物作为扩增引物的上下游引物，以蜜蜂西奈湖病毒的RNA为模板进行RT‑PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测序，然后再拼接比对，得到蜜蜂西奈湖病毒基因组全长序列。本发明专利技术针对蜜蜂西奈湖病毒主要致病基因型，根据基因组所包含的三个开放阅读框设计了的分段扩增策略，并根据保守区域设计相应的扩增引物；其能有效的扩增出蜜蜂西奈湖病毒的全基因组序列。本发明专利技术可广泛应用于蜜蜂及蜂产品、检验检疫等具有蜜蜂西奈湖病毒检测需求及相应的科研领域。

Bee Sinai Lake virus genome amplification primer and amplification method and application thereof

The invention discloses a bee Sinai Lake virus genome amplification primer and a amplification method and an application thereof. The present invention respectively with six pairs of primers as primers, the bees Lake Sinai virus RNA as a template for RT PCR amplification, amplification products were obtained respectively, and then the nucleic acid sequence and sequencing the amplified products, and then spliced alignment, get full-length sequence of bee virus genome in Sinai lake. According to the invention of bees in Sinai Lake virus gene type, according to the three open reading frames contained in the genome of the designed fragment amplification strategy, and the corresponding design primers according to the conservative region; it can effectively amplify the whole genome sequence of bee virus listed in Sinai lake. The invention can be widely applied to bee and bee products, inspection and quarantine, etc., and has the requirements of bee Sinai Lake virus detection and corresponding scientific research fields.

【技术实现步骤摘要】
一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物和扩增方法及其应用
：本专利技术属于生物
，具体涉及一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物和扩增方法及其应用。
技术介绍
：西奈湖病毒(LakeSinaivirus，LSV)，属+ssRNA病毒，基因组长约5600bp，目前发现有7株，LSV1-7。2008年首次发现于美国南达科他(SouthDakota)的靠近西奈湖(LakeSinai)的一个流动养蜂场，随后研究表明该病毒与蜜蜂群体崩溃失调病(CCD)的发生有关。其中LSV2毒性最强，其基因组全长约5910bp，编码衣壳蛋白57.3kDa，包括3个开放阅读框，病毒粒子直径约27nm。LSV可以通过媒介，食物或粪便传播，分布于蜜蜂的肠道、胸部、腹部及头部。但具体病理特征还不清楚。为了研究其病理特征，其纯病毒粒子的获得是关键，但是一般情况下，蜜蜂常携带多种病毒或其他病原，因此获得LSV病毒基因组全长，构建病毒复制体系是关键。因此，基因组信息的获得对于西奈湖病毒研究具有重要意义。目前其基因组信息的获得是高通量测序，再拼接，成本高，对信息生物学技术分析要求高，并且得不到序列进行后续研究，只能获得信息。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种高灵敏度的蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物和扩增方法及其应用。本专利技术的第一个目的是提供蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物：引物对1：LSV-1F：5'-GGGAAGTTTATGCCTCCTAC-3'；LSV-1R：5'-GATGATCGAGAAGAGCTGG-3'；引物对2：Orf1-F-78：5'-ATGAAGGTTGTCTTCTTGGTTTCG-3'；Orf1-R-2615：5'-TTACGCACCTTCGTTTGGGAGGT-3'；引物对3：RdRp-F-1852：5'-ATGATATCAAGTCTTGTGACGC-3'；RdRp-R-3720：5'-TTACGCGTAAAGAACAGACCTAAACT-3'；引物对4：LSV-3630：5'-TTCCTCTTACCGCTATCTTAAG-3'；LSV-3903：5'-GCCTATTAATAGACGAAGGCTG-3'；引物对5：Cap-F-3738：5'-GTGAATCCACCAACTACGACTAC-3'；Cap-R-5300：5'-TTACTTAGCGTCAAAGAAGATGT-3'；引物对6：LSV-5154F：5'-ATCTCCATGTTGCCGGGTGTAGG-3'；LSV-5909R：5'-GCTGTCGCAACAACCAACAGCGTT-3'。本专利技术的第二个目的是提供一种蜜蜂西奈湖病毒基因组的扩增方法，其特征在于，分别以上述引物LSV-1F/LSV-1R、Orf1-F-78/Orf1-R-2615、RdRp-F-1852/RdRp-R-3720、LSV-3630/LSV-3903、Cap-F-3738/Cap-R-5300和LSV-5154F/LSV-5909R作为扩增引物的上下游引物，以蜜蜂西奈湖病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测序，然后再拼接比对，得到蜜蜂西奈湖病毒基因组全长序列。优选，所述的RT-PCR扩增，其反应体系为：含有2×one-stepRT-PCRmixture10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，RNA模板2μL，其余由双蒸水补足至20μL。优选，所述的RT-PCR扩增，其反应条件为：以引物对LSV-1F/LSV-1R作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对Orf1-F-78/Orf1-R-2615作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对RdRp-F-1852/RdRp-R-3720作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对LSV-3630/LSV-3903作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对Cap-F-3738/Cap-R-5300作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min；以引物对LSV-5154F/LSV-5909R作为引物的反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃30s，61℃30s，72℃30s，共30次循环；72℃最后延伸5min。本专利技术的第三个目的是提供蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物在扩增得到蜜蜂西奈湖病毒基因组序列中的应用。本专利技术针对蜜蜂西奈湖病毒主要致病基因型，根据基因组所包含的三个开放阅读框设计了分段扩增策略，并根据保守区域设计相应的扩增引物，能有效的扩增出蜜蜂西奈湖病毒的全基因组序列。本专利技术可广泛应用于蜜蜂及相关蜂产品、检验检疫等具有蜜蜂西奈湖病毒检测需求及相应的科研领域。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。以下实施例所使用的蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物，具体如下：引物对1：LSV-1F：5'-GGGAAGTTTATGCCTCCTAC-3'；LSV-1R：5'-GATGATCGAGAAGAGCTGG-3'；引物对2：Orf1-F-78：5'-ATGAAGGTTGTCTTCTTGGTTTCG-3'；Orf1-R-2615：5'-TTACGCACCTTCGTTTGGGAGGT-3'；引物对3：RdRp-F-1852：5'-ATGATATCAAGTCTTGTGACGC-3'；RdRp-R-3720：5'-TTACGCGTAAAGAACAGACCTAAACT-3'；引物对4：LSV-3630：5'-TTCCTCTTACCGCTATCTTAAG-3'；LSV-3903：5'-GCCTATTAATAGACGAAGGCTG-3'；引物对5：Cap-F-3738：5'-GTGAATCCACCAACTACGACTAC-3'；Cap-R-5300：5'-TTACTTAGCGTCAAAGAAGATGT-3'；引物对6：LSV-5154F：5'-ATCTCCATGTTGCCGGGTGTAGG-3'；LSV-5909R：5'-GCTGTCGCAACAACCAACAGCGTT-3'。实施例1：样本中病毒基因组的扩增效果(1)病毒样本处理及核酸提取：取蜜蜂西奈湖病毒阳性样本，通过PBS溶液(pH7.4，DEPC处理)冲洗待处理样品后，在样品中加入RNA提取液，并按RNA提取试剂盒说明书抽提样本中病毒RNA共60μL。(2)基因组分段扩增法(即分6段扩增，所使用的引物配组如下：LSV-1F/LSV-1R、Orf1-F-78/Orf1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物：引物对1：LSV‑1F：5'‑GGGAAGTTTATGCCTCCTAC‑3'；        LSV‑1R：5'‑GATGATCGAGAAGAGCTGG‑3'；引物对2：Orf1‑F‑78：5'‑ATGAAGGTTGTCTTCTTGGTTTCG‑3'；        Orf1‑R‑2615：5'‑TTACGCACCTTCGTTTGGGAGGT‑3'；引物对3：RdRp‑F‑1852：5'‑ATGATATCAAGTCTTGTGACGC‑3'；        RdRp‑R‑3720：5'‑TTACGCGTAAAGAACAGACCTAAACT‑3'；引物对4：LSV‑3630：5'‑TTCCTCTTACCGCTATCTTAAG‑3'；        LSV‑3903：5'‑GCCTATTAATAGACGAAGGCTG‑3'；引物对5：Cap‑F‑3738：5'‑GTGAATCCACCAACTACGACTAC‑3'；        Cap‑R‑5300：5'‑TTACTTAGCGTCAAAGAAGATGT‑3'；引物对6：LSV‑5154F：5'‑ATCTCCATGTTGCCGGGTGTAGG‑3'；        LSV‑5909R：5'‑GCTGTCGCAACAACCAACAGCGTT‑3'。...

【技术特征摘要】
1.一种蜜蜂西奈湖病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物：引物对1：LSV-1F：5'-GGGAAGTTTATGCCTCCTAC-3'；LSV-1R：5'-GATGATCGAGAAGAGCTGG-3'；引物对2：Orf1-F-78：5'-ATGAAGGTTGTCTTCTTGGTTTCG-3'；Orf1-R-2615：5'-TTACGCACCTTCGTTTGGGAGGT-3'；引物对3：RdRp-F-1852：5'-ATGATATCAAGTCTTGTGACGC-3'；RdRp-R-3720：5'-TTACGCGTAAAGAACAGACCTAAACT-3'；引物对4：LSV-3630：5'-TTCCTCTTACCGCTATCTTAAG-3'；LSV-3903：5'-GCCTATTAATAGACGAAGGCTG-3'；引物对5：Cap-F-3738：5'-GTGAATCCACCAACTACGACTAC-3'；Cap-R-5300：5'-TTACTTAGCGTCAAAGAAGATGT-3'；引物对6：LSV-5154F：5'-ATCTCCATGTTGCCGGGTGTAGG-3'；LSV-5909R：5'-GCTGTCGCAACAACCAACAGCGTT-3'。2.一种蜜蜂西奈湖病毒基因组的扩增方法，其特征在于，分别以权利要求1所述的引物对LSV-1F/LSV-1R、Orf1-F-78/Orf1-R-2615、RdRp-F-1852/RdRp-R-3720、LSV-3630/LSV-3903、Cap-F-3738/Cap-R-5300和LSV-5154F/LSV-5909R作为扩增引物的上下游引物，以蜜蜂西奈湖病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测序，然后再拼接比对，得到蜜蜂西奈湖病毒基因组全长序列。3.根据权利要求2所述的扩增方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张祎，韩日畴，
申请(专利权)人：广东省生物资源应用研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44