水稻核苷酸片段HAL及含该片段的表达载体与应用制造技术

本发明专利技术公开了一个在水稻衰老叶片中高表达的EST，命名为HAL，该段EST长445bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还构建了anti-HAL表达载体，是将HAL序列反向插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游而获得的。该表达载体转入水稻后，通过RNA干扰抑制靶基因在水稻植株中的表达，从而使得水稻植株的株高、穗长得到了明显的增长，水稻植株的有效穗数、枝梗数和穗粒数得到了明显的增加，水稻的粒型得到了明显的增大，水稻的千粒重、产量得到了明显的增加。本发明专利技术的EST在水稻株型和产量改良中具有一定的应用潜力。

Rice nucleotide fragment HAL and expression vector containing the fragment and application thereof

The invention discloses a high expression in rice leaf senescence in EST, named HAL, the EST 445bp, the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1. The invention also constructs a anti-HAL expression vector, which is obtained by inserting the HAL sequence backward into the lower part of the pCAMBIA1304 carrier 35S formation forming promoter. The expression vector in rice, using RNA interference inhibiting the expression of target genes in rice plants, so that the rice plant height, spike length was increased significantly, the number of effective panicles, panicle branches and grains of rice plants were significantly increased, rice grain has been significantly the increase of rice, 1000 grain weight and yield were significantly increased. The EST of the invention has certain application potential in rice plant type and yield improvement.

【技术实现步骤摘要】
水稻核苷酸片段HAL及含该片段的表达载体与应用
本专利技术涉及一个对水稻的株型、穗型、产量等性状有影响的核苷酸片段——HAL，以及含有该片段的重组表达载体，以及其在改良水稻株型、产量等性状中的应用，属于基因工程

技术介绍
水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界有约2/3的人口以水稻为主食。为了满足日益增长的人口对粮食的需求，提高水稻生产力具有重要意义。产量性状是描述水稻生产力的重要农艺性状，主要由有效穗数、每穗谷粒数和千粒重几部分组成。这些产量性状都属于数量性状(QTL)，由许多效应不同的基因所控制。目前国内外利用转基因改良农作物经济性状的技术主要是根据已知的功能基因与表型性状的关系，采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植物，以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良。叶片是水稻最重要的器官，有研究表明水稻抽穗后灌浆所需营养物质的60％～80％来自叶片的光合作用。水稻叶片在结实期间衰老的快慢直接影响水稻的产量，有研究则表明叶片每推迟衰老一天，产量可提高1％左右。这就是“源-库-流”平衡问题，叶片是“源”，种子是“库”，“库”再大，“流”再畅通，而总的“源”有限，产量终究上不去。所以在提高生物量的基础上，实现产量多基因聚合，改善产量性状，才能达到高产。也就是说要提高水稻产量必须改良水稻株型，增加生物量，进而提高水稻植株产量。除了增加水稻生物量改良株型可以提高产量外，延长水稻营养生长期，延缓叶片衰老，增加植株光合作用产物量，也是增加水稻产量的一个途径。叶片衰老最明显的表现就是叶绿素逐渐消失，并出现黄化脱落现象，叶片的衰老程度越严重，叶绿素的含量就越低。然而，植物中存在着一种“持绿”现象，持绿是指叶片在植物生长后期的较长时间内仍保持绿色的一种表型特征。水稻转基因研究表明将抗衰老基因导入水稻能够延缓叶片衰老从而使产量得以提高。叶片衰老过程中有一些基因受到抑制而低水平表达，甚至完全不表达；而另一些基因则被激活，从而增强表达。前一类基因被称为衰老下调基因(senescencedown-regulationgenes,SDGs)，如编码与光合过程有关的蛋白质的转录本丰度随叶片的衰老而急剧下降；后一类则被称为衰老相关基因(senescence-associatedgenes,SAGs)。SAGs又可分为两类：一类仅在衰老阶段才表达，被称为衰老特定基因(senescence-specificgenes,SSGs)，如SAG12、SAG13；另一类在叶片生长初期就可检测到有低水平表达，在衰老开始后表达量迅速上升。本专利技术尝试采用衰老叶片中高表达的一个EST，构建反义表达载体，通过RNA干扰抑制该高表达基因表达，进而延缓植株衰老，增长水稻营养生长期，扩大水稻植株的“源”，为植株产量提高奠定基础。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术在衰老叶片mRNA中发现了一个高表达的EST，并将其命名为HAL(HighlyexpressinginApoptosisLeaves)，对其进行克隆，构建反义表达载体，并将该表达载体转化到水稻中，通过RNA干扰抑制靶基因在水稻植株中的表达，结果表明该EST在水稻株型和产量改良中具有一定的应用潜力。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一个水稻核苷酸片段，是在水稻衰老叶片转录组芯片结果中发现的一段高表达的EST，设计引物将其从金23B反转录cDNA序列中分离和克隆到，将其命名为HAL(HighlyexpressinginApoptosisLeaves)，该段EST长445bp，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。一种含有上述核苷酸片段HAL的重组表达载体，由核苷酸片段HAL反向插入到空白表达载体而成。优选的，所述含有核苷酸片段HAL的重组表达载体所用空白表达载体为pCAMBIA1304，HAL序列反向插入的位点为pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游(由此构建的重组表达载体命名为anti-HAL表达载体)。所述anti-HAL表达载体的构建方法为：大多数基因工程都是将基因的核苷酸编码序列正向插入载体，而本专利技术是将HAL反向插入载体；所述HAL反向序列如SEQIDNO.2所示；构建重组表达载体时，采用pCAMBIA1304(CenterfortheApplicationofMolecularBiologyofInternationalAgriculture,Canberra,ACT，Australia)为表达载体，利用酶切位点BglII和SpeI将HAL反向序列插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游，得到反义表达HAL的表达载体，其结构图如图1所示。本专利技术构建的含有核苷酸片段HAL的重组表达载体(anti-HAL表达载体)，转入水稻后，经实验证明，可干扰抑制HAL在水稻植株(水稻品种包括籼稻金23B和炳1B)中的表达，可增加水稻植株的有效穗数、枝梗数和穗粒数，增加产量，具体表现为：转基因水稻的株高大于转化水稻品种；转基因水稻的穗长大于转化水稻品种；转基因水稻的千粒重大于转化水稻品种。本专利技术在衰老叶片mRNA中发现了一个高表达的EST，并将其命名为HAL(HighlyexpressinginApoptosisLeaves)，对其进行克隆，首次将组成型表达调控的花椰菜病毒35S启动子与HAL反义互补序列进行融合，并将该融合表达载体转化到水稻中，通过RNA干扰抑制靶基因在水稻植株中表达，改变了水稻的株型、穗型、产量等性状。本专利技术的EST在水稻株型和产量改良中具有一定的应用潜力。附图说明图1为水稻Anti-HAL基因的表达载体结构图。图2为HAL基因在野生型植株金23B和Anti-HAL转基因植株中表达量的对比。图3为Anti-HAL转基因植株株高变化。图4为Anti-HAL转基因植株产量性状变化。图5为Anti-HAL转基因植株千粒重和总重变化。图6为Anti-HAL转基因植株结实率变化。图7为Anti-HAL转基因植株和金23B对照的14天幼苗对比。图8为Anti-HAL转基因植株和金23B对照的苗期叶片衰老对比。图9为Anti-HAL转基因植株和金23B对照的株型对比。图10为Anti-HAL转基因植株和金23B对照的稻穗对比。图11为Anti-HAL转基因植株和金23B对照的粒型对比。图12为Anti-HAL转基因植株和金23B对照的根横切面对比，其中，A为金23B；B为Anti-HAL转基因。图13为Anti-HAL转基因植株和金23B对照的茎横切面对比，其中，A为金23B；B为Anti-HAL转基因。图14为Anti-HAL转基因植株和金23B对照的茎纵切面对比，其中，A为金23B；B为Anti-HAL转基因。图15为Anti-HAL转基因植株和金23B对照的叶横切面对比。图16为Anti-HAL转基因植株和金23B对照的颖壳横切面对比，其中，A为金23B；B为Anti-HAL转基因。图17为Anti-HAL转基因植株转育炳1B和三个对照株的抽穗期株型对比。图18为Anti-HAL转基因植株转育炳1B和三个对照株的抽穗期穗型对比。图19为Anti-HAL转基因植株转育炳1B和三个对照株的抽穗期粒型对比。具体实施方式下面结合实施例对本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个水稻核苷酸片段，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一个水稻核苷酸片段，其特征在于：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种重组表达载体，其特征在于：由权利要求1所述的核苷酸片段HAL反向插入到空白表达载体而成。3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述空白表达载体为pCAMBIA1304，HAL序列反向插入的位点为pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游。4.权利要求3所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于：采用pCAMBIA1304为表达载体，利用酶切位点BglII和SpeI将HAL反向序列插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游，得到反义表达HAL的表达载体，所述HAL反向序列如SEQIDNO.2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗小金，董贤欣，杨金水，孙凡，姜玲，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31