一种用于检测ApoM启动子基因序列的引物对及其检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于检测ApoM启动子基因序列的引物对及其检测方法和试剂盒，所述引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述引物对用于检测ApoM基因启动子区rs805396和‑724两个位点。所述检测方法包括提取基因组DNA,设计引物对，以全基因组为模板进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并纯化；对纯化后的PCR扩增产物进行测序，分析测序结果并判断是否发生突变。该检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果可靠准确，根据检测方法设计出的相关试剂盒使用简便可行。

Primer pair for detecting ApoM promoter gene sequence, detection method and kit thereof

The invention discloses a method for detecting ApoM gene promoter sequence primer detection method and kit thereof, wherein the nucleotide sequence of SEQ primer pairs is ID NO:1 and SEQ ID as shown in NO:2, the primers to start rs805396 and sub region for the detection of ApoM gene of 724 two bit point. The detection method includes extracting genomic DNA, design primers, using the whole genome as template for PCR amplification, recovery and purification of PCR products; the purified PCR amplification products were sequenced. Sequence analysis results and determine whether the mutation. The detection method has the advantages of artful design, simple operation and reliable and accurate detection result. The relevant reagent box designed according to the detection method is simple and feasible to use.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测ApoM启动子基因序列的引物对及其检测方法和试剂盒
本专利技术属于基因相关位点检测
，具体涉及一种用于检测ApoM启动子基因序列的引物对及其检测方法和试剂盒。
技术介绍
目前全世界糖尿病患者的数量已达3.66亿，全球每7秒种就有一人死于糖尿病。糖尿病是指以血糖增高为主要临床表现的慢性代谢性疾病，主要分为1型糖尿病和2型糖尿病，2型糖尿病占糖尿病患者90％以上。1型糖尿病是一种自体免疫疾病，是由于免疫系统对分泌胰岛素的胰腺β细胞作出攻击导致胰腺不能分泌足够的胰岛素。而2型糖尿病是由于各种致病因素导致组织器官产生胰岛素抵抗，即胰岛素相对缺乏，故通常临床上用胰岛素释放实验来区别糖尿病的类型。患者试验空腹及进食75克葡萄糖后30分钟、60分钟、120分钟和180分钟分别抽血测定胰岛素及C肽水平。若空腹胰岛素及C肽低于正常，且进食后不增高考虑为1型糖尿病；若空腹胰岛素及C肽低于正常、增高或降低，且进食后增高，则考虑为2型糖尿病。2型糖尿病具体的致病原因仍然未知，现在的研究发现其是由遗传因素和环境因素共同作用导致的，其中遗传因素约占30％,环境因素约占70％。2型糖尿病的遗传风险是由多个基因共同决定的，目前为止,公认的2型糖尿病易感基因已经增至20个,同时还发现了13个影响空腹血糖的基因以及5个影响餐后血糖的基因。临床常规检查例如空腹及餐后血糖、糖化血红蛋白、C肽水平只能判断2型糖尿病的发生发展情况，但无法找到致病根源，无法根据这些指标做出及时的预防和根本性的治疗，而基因检测通过对2型糖尿病相关易感基因进行检查，能够准确的发现致病基因，准确率达到99.9999％，真正做到快速诊断疾病，发现致病根源，提前预知2型糖尿病发病风险，可通过调节饮食结构和生活方式，有效的控制疾病的发生与发展，防止并发症，还具有缩短检查流程，提升检查准确性，精确药物用量，减少药物毒副作用，提高药物治疗效果等一系列的优势。对此，我们应该尽量多发现和研究一些与2型糖尿病相关的基因易感性位点，做到有病先来防，有病正确对待并及早调整和治疗。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提供一种用于检测ApoM启动子基因序列的引物对及其检测方法和试剂盒，该检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果可靠准确，试剂盒使用简便可行，为后续的检测手段以及进一步采取有针对性的健康管理、疾病预防提供参考依据。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种引物对，所述引物对是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述引物对用于检测ApoM基因启动子区rs805396和-724两个位点。一种用于检测ApoM启动子基因序列相关位点的检测方法，包括如下步骤：A、提取全基因组DNA；B、根据ApoM启动子基因序列及位点设计引物对，对提取的全基因组DNA进行PCR扩增，回收PCR产物并割胶纯化；C、对纯化后的PCR产物进行测序，并分析测序结果来判断ApoM启动子基因是否发生突变。一种用于检测ApoM启动子基因序列的试剂盒，所述试剂盒内包括基因组DNA抽提试剂盒、PCR扩增产物纯化试剂盒、PCR反应试剂盒、BigDye测序反应试剂盒、无水乙醇试剂瓶和盛放引物对的容器。所述试剂盒内还设有控温装置。所述试剂盒内设有托架，所述托架设有六个凹槽容纳腔，六个凹槽容纳腔内分别放置所述基因组DNA抽提试剂盒、PCR扩增产物纯化试剂盒、PCR反应试剂盒、BigDye测序反应试剂盒、无水乙醇试剂瓶和盛放引物对的容器。所述凹槽容纳腔的内周向侧壁设有缓冲结构。所述试剂盒包括盒体和盖合在盒体上的盒盖，所述盒盖与盒体铰接。所述盒体与盒盖的盖合处设有密封垫。本专利技术的有益效果：本专利技术首次发现了ApoM基因的启动子区-724位点是2型糖尿病相关位点，与已知的rs805396位置相近，设计特异性的一对引物，以来自人的组织、全血样本提取全基因组DNA模板进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，该检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果可靠准确，根据检测方法设计出的相关试剂盒使用简便可行。使用本试剂盒检测这两个相关位点，并根据这两个相关位点的具体状况作为2型糖尿病健康管理的主线，监控疾病的发生发展。如果是2型糖尿病遗传倾向较高的人群，及时预防2型糖尿病的外在致病因素，并按时完善预防性的相关的检查，例如空腹、餐后血糖，做到及早预防，早发现，早治疗甚至避免疾病的发生。通过本专利技术试剂盒的设计，便于放置实施检测方法过程中所使用的试剂，更利于检测试验的进行，试剂盒内控温装置的设置，便于使试剂盒在运输过程，或者取出试剂做实验过程中保持试剂盒中的试剂基本维持在实验所需要的温度。缓冲结构的设置，使放置物能够较好的固定在凹槽容纳腔内，在运输过程中不易晃动，使试剂盒在移动过程中不会造成凹槽容纳腔内放置物易破损情况的发生。附图说明本说明书包括以下附图，所示内容分别是：图1是本专利技术试剂盒的结构示意图。图中标记为：1、基因组DNA抽提试剂盒，2、PCR扩增产物纯化试剂盒，3、PCR反应试剂盒，4、BigDye测序反应试剂盒，5、无水乙醇试剂瓶，6、盛放引物对的容器，7、控温装置。具体实施方式下面对照附图，通过对实施例的描述，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明，目的是帮助本领域的技术人员对本专利技术的构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，并有助于其实施。1.基因组DNA提取:1.1试剂和仪器:1.1.1试剂和耗材：基因组DNA抽提试剂盒(TIANampBLOODDNAkit,DP318-03；TIANamp口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，DP322-03)含:细胞裂解液CL；缓冲液GA；缓冲液GS；缓冲液GB；缓冲液GD；漂洗液PW；洗脱缓冲液TB；CarrierRNA；RNase-freeddH2O；蛋白酶K(20mg/ml)；吸附柱；收集管(2ML)；1.5ML无菌收集管；无水乙醇。1.1.2仪器:BECKMANCOULTER20R离心机；QilinbeierVORTEX-5旋涡混合器；HH-W600电热恒温水浴锅。1.2提取步骤从全血中提取基因组DNA1.2.1取200u1的抗凝全血至1.5m1的Eppendorf管中，如果样本的量少于200u1，则加入缓冲液GS补充至200u1。如果样本量多于200u1，需要用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下：在样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL,颠倒混匀，10000rpm离心1分钟，吸取上清，留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次)，向离心收集到的细胞核沉淀中加200u1缓冲液GS，振荡至彻底混匀。1.2.2加入20u1的蛋白酶K溶液，混匀，再加入200u的缓冲液GB，立刻充分颠倒混匀。56℃水浴样本10分钟，水浴过程中请每隔3分钟上下轻柔颠倒混匀样本，溶液应变清亮。(如溶液未彻底变清亮，可延长裂解时间至溶液变清亮为止)。1.2.3加入200u1无水乙醇，充分颠倒混匀，这时可能会出现絮状沉淀。1.2.4将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13,400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。1.2.5向吸附柱中加入500ul缓冲液GD(使用前请本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物对，所述引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其特征在于：所述引物对用于检测ApoM基因启动子区rs805396和‑724两个位点。

【技术特征摘要】
1.一种引物对，所述引物对是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，其特征在于：所述引物对用于检测ApoM基因启动子区rs805396和-724两个位点。2.一种用于检测ApoM启动子基因序列相关位点的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：A、提取全基因组DNA；B、根据ApoM启动子基因序列及位点设计引物对，对提取的全基因组DNA进行PCR扩增，回收PCR产物并割胶纯化；C、对纯化后的PCR产物进行测序，并分析测序结果来判断ApoM启动子基因是否发生突变。3.一种用于检测ApoM启动子基因序列的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括基因组DNA抽提试剂盒、PCR扩增产物纯化试剂盒、PCR反应试剂盒、BigDye测序反应试剂盒、无水乙醇试剂瓶和盛放引物对的容器。4.根据权利要求3所述用于检...

【专利技术属性】
技术研发人员：章尧，张普宏，高家林，孟宇，王李卓，吕俊，
申请(专利权)人：皖南医学院，
类型：发明
国别省市：安徽,34