一种花生AhLEC1B组成型启动子的克隆和应用制造技术

一种花生AhLEC1B组成型启动子的克隆和应用。本发明专利技术属于生物技术领域，从花生中克隆获得了一种花生AhLEC1B组成型启动子，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，该启动子通过GUS组织化学染色证实其驱动基因在植物根、茎、叶、花和种胚等器官中呈组成型高效表达，发明专利技术人基于该启动子的上述功能，构建了该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥，证实该启动子对于GUS基因的驱动功效与CaMV35S近似，且该启动子片段大小适中，利于构建，适于实验室和工业应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子遗传学领域，特别是植物转基因
，具体涉及了一个新的来源于花生AhLEC1B基因的组成型启动子的克隆和应用。
技术介绍
启动子是位于结构基因5′端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子决定着转录的方向和转录的效率，同时对所使用的RNA聚合酶类型也起着决定性作用，是理解基因表达和转录调控机制的关键，是植物基因转录调控的中心。按作用方式和功能，可将启动子分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。目前在植物基因工程研究中，组成型启动子的应用最早、最为广泛。在转基因育种或用于研究基因功能时，为了充分发挥外源基因表达产物的功能一般都使用组成型启动子使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。在双子叶转基因植物中使用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子。单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和水稻的ActinI启动子，另外还有来自章鱼碱合成酶基因Ocs启动子和根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因Nos启动子。有研究表明内源型启动子在驱动转基因盐藻外源基因的高效稳定表达中比外源启动子更具有优势。此外在植物基因工程中应用从病毒中克隆出来的启动子序列，可能存在潜在的生物不安全性。并且，重复使用同一种组成型启动子驱动两个或两个以上的外源基因表达可能会引起基因沉默或共抑制现象。因此，寻找双子叶植物组成型启动子，对于双子叶植物的遗传改良具有重要应用价值。近年来，国内外多个实验室开展了花生抗逆和籽粒储藏物质积累相关基因启动子的克隆与研究，旨在充分了解基因的表达调控特征，为作物遗传改良提供依据。花生籽粒中多个主要储藏蛋白—过敏原Arah1、2、3和6基因的启动子已被克隆和鉴定(Viquez等,2003；2004；Zhong等,2006；Bhattacharya等,2012)，花生Arah2启动子驱动GUS在种胚中特异表达，且强度高于35S启动子，而在种皮中基本无表达；花生Arah 6启动子驱动GUS在子叶中表达，而在真叶中表达较弱。花生油体蛋白基因AhOleo17.8、AhOleo18.5启动子(Li et al.,2009)和脂肪酸合成与油脂积累相关的基因如AhDGAT3(唐桂英等,2013)、AhACP(单雷等，2014)启动子，也相继获得克隆与分析。干旱胁迫下花生中调控脱落酸生物合成的AhNCED1基因启动子(梁建华等,2007)、抵御外来病害相关的ARAhPR10基因启动子(温世杰等,2012)也已被克隆研究。
技术实现思路
基于上述现有技术，本专利技术的专利技术人经过深入研究，从花生中克隆获得了一个新的组成型启动子，该启动子来源于花生AhLEC1B基因，该启动子核苷酸序列如Seq ID No:1所示，包括5′端非翻译区52bp和其上游66bp区段，具有高效驱动功能。本专利技术构建了该启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。实验表明，自起始密码起-32～-149调控区的启动子驱动的GUS基因在转基因植株的根、茎、叶、花、种胚中均能高效表达，且驱动效率与CaMV35S近似。该启动子是在通过染色体步移技术获得AhLEC1B基因5′端上游1289bp序列(其核苷酸序列如Seq ID No:2所示)的基础上，设计特异引物进行扩增得到的118bp AhLEC1B基因5′端上游序列，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示。经转录起始位点分析发现，花生AhLEC1B基因转录起始位点位于翻译起始密码ATG上游-83nt处，通过PlantCARE和PLACE软件对该118bp AhLEC1B基因启动子进行顺式调控元件分析，该序列除包含启动子中心元件TATA BOX、增强启动子活性的CCAAT BOX，还包含叶肉表达调控元件CACTFT PPCA1(YACT)、花粉中表达调控元件GTGA Motif(GTGA)，另外，还包含植物特有的碳代谢相关的Dof蛋白结合位点DOF CORE、细胞分裂素响应调控元件ARR1AT(NGATT)及光响应调控元件GATA BOX(GATA)、GT1 CONSENSUS(GRWAAW)。存在启动子调控元件的位置如说明书附图2所示。为了完成该启动子的初步功能分析，本专利技术以pCAMBIA3301为出发载体构建了含有本专利技术所述花生AhLEC1B基因启动子驱动的GUS基因植物表达载体，即用花生AhLEC1B基因启动子118bp片段取代pCAMBIA3301中驱动GUS基因表达的35S启动子，获得的植物表达载体转化农杆菌后，用花序浸染法转化拟南芥，即待拟南芥繁殖开花时，配制浸染液，用农杆菌浸染将要开放的花序。本专利技术分别取转基因拟南芥的根、茎、叶、花和种胚，通过现有的方法检测GUS基因的表达情况。本专利技术所提供的启动子区域，包括5′端非翻译区52bp和其上游启动子66bp区段，其基因序列如Seq ID No:1所示，可驱动GUS基因在根、茎、叶、花和种胚中高效表达。由此可见本专利技术克隆获得的花生AhLEC1B基因的启动子组成型表达特性。通过上述实验，专利技术人证实了，在本专利技术提供的118bp 5′端上游调控区包括非翻译区52bp和其上游启动子66bp区段具有高效组成型表达特性，可以应用在植物遗传工程，构建该启动子和相关基因的表达载体，通过转基因手段定向改变植物性状，如增强植物耐受生物或非生物胁迫能力、提高植物对除草剂抗性、改善粮食营养组分等。因此，该启动子的克隆对植物转基因
启动子的研究也具有重要意义。附图说明图1为扩增的花生AhLEC1B基因118bp 5′端上游序列扩增的电泳图，图中M为Trans2K DNA Marker；P为扩增的目的启动子片段；由图中结合实施例可知，扩增得到的序列为118bp，包括66bp的启动子序列、52bp 5′非编码区序列；图2为本专利技术所述花生AhLEC1B组成型启动子区域可能的顺式作用元件；图3为扩增花生AhLEC1B基因1289bp 5′端上游序列扩增的电泳图，图中M为Trans2K DNA Marker，LD、LE、LP和LS为不同基因组文库扩增结果，LP泳道箭头所指为扩增的目的启动子片段；图4为花生AhLEC1B基因启动子序列与GUS基因的融合表达载体的构建流程图；图5为本专利技术所提供的包括52bp5′非编码区序列和66bp的启动子序列区段驱动的GUS基因表达结构转基因拟南芥根、茎、叶、花和种胚GUS活性组织化学检测图；图中自上而下为拟南芥的根和叶、茎、花和种胚；CK-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种花生AhLEC1B组成型启动子，其特征在于：其核苷酸序列如Seq ID No:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种花生AhLEC1B组成型启动子，其特征在于：其核苷酸序列如Seq ID No:1所示。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于：该启动子能驱动GUS基因主要在花
生各器官高效组成型...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐桂英，单雷，徐平丽，柳展基，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，唐桂英，
类型：发明
国别省市：山东;37