本发明专利技术公开了一种有效抑制KCNA3基因表达的shRNA、编码该shRNA的DNA序列及其应用，所述编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列为5’至3’碱基组成依次由SEQ ID NO.1、环结构序列、SEQ ID NO.1的反向互补序列构成的单链或者双链；或所述DNA序列为5’至3’碱基组成依次由SEQ ID NO.2、环结构序列、SEQ ID NO.2的反向互补序列构成的单链或者双链。本发明专利技术还公开了含有上述DNA序列的慢病毒表达载体、慢病毒、细胞株及其制备方法。本发明专利技术所述的选择性沉默KCNA3基因的shRNA能够在mRNA水平上高效率地抑制细胞中KCNA3蛋白的表达，且沉默效果稳定，细胞的增殖分裂不对其产生影响。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体是涉及有效抑制小鼠 KCNA3基因表达的DNA、 shRNA及其应用。
技术介绍
KCNA3基因编码KCNA3离子通道。KCNA3离子通道属于电压门控钾离子通道家族 (简称Kv)，Kvl亚型，属于一类延迟整流钾离子通道，可以被电压激活而选择性通透钾离子 (K+)。KvL 3离子通道在淋巴细胞、癌细胞和神经细胞上均有表达。人类KCNA3通道是T 淋巴细胞膜上的一种主要离子通道，研宄表明，KCNA3可能参与人类炎症性神经细胞疾病。 KCNA3在目前的研宄中，被广泛应用为炎症性神经系统疾病的治疗靶点。 RNA干扰是由细胞内源自行产生或者由人为外源导入的RNA片段介导发生的一种 基因转录水平或者基因转录后水平的基因沉默现象。随着RNA干扰（RNAi)技术的不断深 入发展，RNAi已经成为基因功能研宄和基因治疗领域最热门的技术之一。目前应用于哺乳 动物的RNAi方法通常为：体外化学合成s iRNA (短干扰RNA)，再将合成好的s iRNA转入 细胞。然而，这种常见的方法转染效率较低、RNA结构易降解、且沉默时间极短（仅为3-5 天）。shRNA技术克服了这些缺点，可以高效率且长期稳定地在细胞株内沉默靶标基因，其 沉默效果不受到细胞分裂影响。此外，shRNA慢病毒载体感染目标细胞株后，可以通过荧光 筛选或者抗生素筛选等方式，避免未感染的细胞干扰后续实验。 本专利技术针对KCNA3基因设计特异性的shRNA序列，构建相应的慢病毒感染系统，为 以后深入研宄KCNA3离子通道的功能奠定了技术基础，也可以应用于炎症性神经系统疾病 治疗的研宄，具有重要的应用前景和经济价值。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种有效抑制KCNA3基因表达的shRNA和相应的DNA序 列。 实现上述目的的技术方案如下。 一种编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列，所述DNA序列为5'至3'碱 基组成依次由SEQ ID NO. 1、环结构序列、SEQ ID NO. 1的反向互补序列构成的单链或者双 链；或所述DNA序列为5'至3'碱基组成依次由SEQ ID NO. 2、环结构序列、SEQ ID NO. 2的 反向互补序列构成的单链或者双链。 在其中一个实施例中，所述环结构序列为ttcaagaga或tctcttgaa。 一种抑制KCNA3基因表达的shRNA，其为由上述DNA序列编码得到的RNA序列。 本专利技术的另一目的是提供一种慢病毒载体质粒及其制备方法。 具体技术方案如下。 含有上述编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列的慢病毒表达载体质粒。 含有上述的编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列的慢病毒表达载体质粒 的制备方法，包括以下步骤： 1)将引物 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8,或 SEQID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12分别加水稀释后，退火，得到两对可以 编码shRNA的双链DNA ; 2)分别将双链DNA与酶切好的载体用T4连接酶接，转化，筛选得到重组质粒，即得 慢病毒表达载体质粒。 本专利技术的另一目的是提供一种慢病毒。 具体技术方案如下。 含有上述慢病毒表达载体的慢病毒。 本专利技术的另一目的是提供一种KCNA3基因表达抑制的细胞株及其制备方法。 具体技术方案如下。 含有上述慢病毒的可传代的KCNA3基因表达抑制的细胞株。 含有上述慢病毒的可传代的KCNA3基因表达抑制的细胞株的制备方法，包括如下 步骤： 1)将慢病毒表达载体质粒与辅助质粒共转染至293T细胞中，收集，过滤，得到含 有包装好的慢病毒颗粒的病毒液； 2)在目标细胞（目标细胞为小鼠细胞，如小鼠神经干细胞等）培养基中加入病毒 液，培养后筛选得到可传代的KCNA3表达抑制的细胞株。 在其中一个实施例中，步骤2)为：在细胞培养基中加入病毒液，培养3-5天后于荧 光显微镜下观察目标细胞的荧光情况；带有红色荧光的细胞即为被病毒感染的细胞；随后 将感染后的目标细胞扩增培养，使用活细胞流式细胞仪筛选带有红色荧光的细胞，即可得 到纯度较高的KCNA3沉默细胞株。 本专利技术的另一目的是提供一种上述DNA或shRNA的应用。 具体技术方案如下。 上述编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA或上述shRNA序列在抑制 KCNA3基因表达中的应用。 本专利技术相对于现有技术具有如下优点及效果： 1)本专利技术所述的选择性沉默KCNA3基因的所述DNA所编码的shRNA能够在mRNA 水平上高效率地抑制细胞中KCNA3蛋白的表达，且沉默效果稳定，细胞的增殖分裂不对其 沉默效果产生影响。 2)本专利技术可得到纯度较高的KCNA3沉默细胞株，有效降低后续实验中源于KCNA3 未被沉默细胞的干扰。 3)本专利技术提供的shRNA_KCNA3慢病毒载体不仅适用于体外培养的细胞体系，也适 用于动物模型等体内实验。因此，本专利技术对于深入研宄KCNA3蛋白的功能和炎症性神经系 统疾病的治疗，均具有重要的科学意义和应用前景。【附图说明】 图I :shRNA重组慢病毒载体沉默靶细胞KCNA3基因的工艺流程； 图2 :病毒感染的小鼠神经干细胞经流式分选后的荧光对比图； 图3 :荧光定量PCR实验中PCR产物溶解曲线； 图4 :shRNA慢病毒感染后小鼠神经干细胞中KCNA3的mRNA表达水平。【具体实施方式】 下面结合【具体实施方式】和附图对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的实施方式 不限于此。 应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室 手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。 I. ShRNA序列的设计与编码shRNA序列的DNA序列的合成 shRNA 序列设计：通过 NCBI 数据库(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/gene/)查询 小鼠 KCNA3基因的mRNA信息（NM_008418. 2)，设计shRNA序列。然后进一步经过筛选后， 选择了 4条靶向小鼠 KCNA3基因的shRNA序列，在此基础上再增加一条Nonsense(NS)对 照组。4条shRNA序列靶向KCNA3基因的位点分别为：NM_008418:1689-1709,1537-1557， 588-608,1521-1541。shRNA 靶向的 DNA 序列如下表：【主权项】1. 一种编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列为 5'至3'碱基组成依次由SEQ ID NO. 1、环结构序列、SEQ ID NO. 1的反向互补序列构成的 单链或者双链；或所述DNA序列为5'至3'碱基组成依次由SEQ ID NO. 2、环结构序列、SEQ ID NO. 2的反向互补序列构成的单链或者双链。2. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码抑制KCNA3基因表达的shRNA的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列为5’至3’碱基组成依次由SEQ ID NO.1、环结构序列、SEQ ID NO.1的反向互补序列构成的单链或者双链；或所述DNA序列为5’至3’碱基组成依次由SEQ ID NO.2、环结构序列、SEQ ID NO.2的反向互补序列构成的单链或者双链。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李志远，周雨叶，萧卓，侯国强，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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