抑制EGFR基因表达的siRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抑制EGFR基因表达的siRNA及其应用。所述siRNA的核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任意一种：正义链：5’‑GCAGAUCAUCAGAGGAAAU‑3’，反义链：5’‑AUUUCCUCUGAUGAUCUGC‑3’；正义链：5’‑CCAAGGAAGCCAAGCCAAA‑3’，反义链：5’‑UUUGGCUUGGCUUCCUUGG‑3’；正义链：5’‑GGAGAUAAGUGAUGGAGAU‑3’，反义链：5’‑AUCUCCAUCACUUAUCUCC‑3’。这些siRNA可以特异高效地抑制EGFR基因表达，降低细胞生长增殖速率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抑制EGFR基因表达的siRNA及其应用，属于分子生物与生物医药

技术介绍
RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，是细胞出现靶基因缺失的表型。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)为21-25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸,可有效地定位目标mRNA，siRNA具有特殊的结构特征，即5’端磷酸基团和3’端的羟基，其两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。由siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核糖体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。同时，siRNA可以作为特殊的引物，在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模版合成dsRNA，后者又可被降解为新的siRNA，重新进入上述循环。因此，即使外源siRNA的注入量较低，该信号也可能迅速被放大，导致全面的基因沉默。表皮生长因子受体(epidermal growth factory receptor，EGFR)是一个由单一肽链组成的跨膜糖蛋白，由氨基端细胞外配体结合结构域、疏水性单一跨膜α-螺旋和胞浆酪氨酸激酶结构域组成，C-端含有数个重要的酪氨酸残基和受体调节基序，属于HER家族，主要分布于细胞膜的表面。EGFR在许多肿瘤中过表达或发生突变，其主要作用机制是通过与细胞外的配体结合后进行同源或异源二聚化，引起胞内酪氨酸残基自身磷酸化，活化的受体募集信号合体并活化下游信号转导蛋白，从而调节肿瘤细胞的生长、侵袭、转化、血管生成及转移。人类恶性肿瘤普遍表达EGFR，上消化道、结肠、胰腺、乳腺、卵巢、膀胱、肾等组织恶性肿瘤和神经胶质瘤中EGFR mRNA或蛋白表达过量，或伴有EGFR基因的扩增。研究显示，与不表达EGFR配体的肿瘤相比，共表达EGFR及其配体的肿瘤生长迅速，恶性度高，患者生存期短。EGFR除了能刺激肿瘤细胞增殖外，还与肿瘤细胞血管形成有关。许多肿瘤组织同时表达EGFR及其配体，能够通过自分泌和旁分泌途径活化EGFR。已有的体内外研究表明，用EGFR抑制剂阻断肿瘤细胞内EGFR活化的信号通路能够抑制肿瘤细胞的增殖和生存。另外，研究发现成人EGFR缺乏明显的生理作用，而EGFR过表达与肿瘤患者预后较差相关，这些研究结果表明EGFR及其配体网络可作为肿瘤分子治疗策略的合理靶位。采用
RNAi技术研究EGFR在肿瘤发病过程中行使的功能是对肿瘤发病机制研究的重要补充。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供能够特异高效地抑制EGFR基因表达的siRNA及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：抑制EGFR基因表达的siRNA，其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任意一种：正义链：5’-GCAGAUCAUCAGAGGAAAU-3’，反义链：5’-AUUUCCUCUGAUGAUCUGC-3’；正义链：5’-CCAAGGAAGCCAAGCCAAA-3’，反义链：5’-UUUGGCUUGGCUUCCUUGG-3’；正义链：5’-GGAGAUAAGUGAUGGAGAU-3’，反义链：5’-AUCUCCAUCACUUAUCUCC-3’。本专利技术还包括上述抑制EGFR基因表达的siRNA在制备预防或治疗人类表皮生长因子受体相关的疾病的药物中的应用。具体的，所述的疾病为肺癌。进一步地，本专利技术还提供一种降低人非小细胞肺癌NCI-H460细胞生长增殖率的方法，具体为：将上述siRNA导入目的细胞，使目的细胞的生长增殖速率下降。与现有技术相比，本专利技术提供一系列新的抑制EGFR基因表达的siRNA及其在制药中的应用，体外试验结果表明，这些siRNA可以特异高效地抑制EGFR基因表达，降低细胞生长增殖速率。附图说明图1为实施例2中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平的实时拍照图；图2为实施例2中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平定量图；图3为实施例3中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后各处理组细胞被AO/EB染色的形态图，其中(a)为空白对照组，(b)为阴性对照组，(c)为EGFR siRNA正常实验组；图4为实施例4中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平的实时拍照图；图5为实施例4中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平定量图；图6为实施例5中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后各处理组细胞胞被AO/EB染色的形态图，其中(a)为空白对照组，(b)为阴性对照组，(c)为EGFR siRNA正常实验组；图7为实施例6中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平的实时拍照图；图8为实施例6中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平定量图。图9为实施例7中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后各处理组细胞被AO/EB染色的形态图，其中(a)为空白对照组，(b)为阴性对照组，(c)为EGFR siRNA正常实验组。具体实施方式本专利技术提供了三种抑制EGFR基因表达的siRNA，分别如下：第一种：正义链：5’-GCAGAUCAUCAGAGGAAAU-3’(SEQ ID NO.1)，反义链：5’-AUUUCCUCUGAUGAUCUGC-3’(SEQ ID NO.2)；第二种：正义链：5’-CCAAGGAAGCCAAGCCAAA-3’(SEQ ID NO.3)，反义链：5’-UUUGGCUUGGCUUCCUUGG-3’(SEQ ID NO.4)；第三种：正义链：5’-GGAGAUAAGUGAUGGAGAU-3’(SEQ ID NO.5)，反义链：5’-AUCUCCAUCACUUAUCUCC-3’(SEQ ID NO.6)。本专利技术还提供上述抑制EGFR基因表达的siRNA在制备预防或治疗人类表皮生长因子受体相关的疾病的药物中的应用，具体是在制备预防或治疗人类肺癌的药物中的应用。本专利技术进一步还提供一种降低人非小细胞肺癌NCI-H460细胞生长增殖率的方法，具体为：将上述siRNA导入目的细胞，使目的细胞的生长增殖速率下降。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详述,以更好地理解本专利技术的内容,但本专利技术并不限于以下实施例。下述各实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述各实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为来自常规生化试剂商店购买得到的。人非小细胞肺癌NCI-H460，购于中国科学院细胞库。GibcoTM DMEM basic(1X)培养液、GibcoTM FBS Qualifieg Australia O本文档来自技高网...

【技术保护点】
抑制EGFR基因表达的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任意一种：正义链：5’‑GCAGAUCAUCAGAGGAAAU‑3’，反义链：5’‑AUUUCCUCUGAUGAUCUGC‑3’；正义链：5’‑CCAAGGAAGCCAAGCCAAA‑3’，反义链：5’‑UUUGGCUUGGCUUCCUUGG‑3’；正义链：5’‑GGAGAUAAGUGAUGGAGAU‑3’，反义链：5’‑AUCUCCAUCACUUAUCUCC‑3’ 。

【技术特征摘要】
1.抑制EGFR基因表达的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任意一种：正义链：5’-GCAGAUCAUCAGAGGAAAU-3’，反义链：5’-AUUUCCUCUGAUGAUCUGC-3’；正义链：5’-CCAAGGAAGCCAAGCCAAA-3’，反义链：5’-UUUGGCUUGGCUUCCUUGG-3’；正义链：5’-GGAGAUAAGUGAUGGAGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国海，彭艳，吴亦明，曾淑兰，
申请(专利权)人：广西师范大学，
类型：发明
国别省市：广西;45