催化UDP-鼠李糖生物合成的基因CsRHMb及其编码蛋白和应用制造技术

本发明专利技术提供一种高效催化UDP‑鼠李糖生物合成的基因CsRHMb、其编码蛋白及工程菌，该基因是从茶叶鲜叶中分离并克隆获得的，其编码蛋白在以UDP‑葡萄糖为底物，且在NADPH存在的反应体系中，该蛋白或由工程菌表达的重组蛋白能将UDP‑葡萄糖高效转化生成UDP‑鼠李糖。本发明专利技术提供了一种高效安全的UDP‑鼠李糖生物合成技术，利用生物工程方法优化了酶的最适反应条件，为实现UDP‑鼠李糖的商品化生产提供了基础。

Udp-l-rhamnose biosynthesis catalyzed by UDP CsRHMb gene and its encoding protein and Application

The present invention provides a highly efficient catalytic gene CsRHMb, UDP udp-l-rhamnose biosynthesis protein and its encoding gene engineering bacteria, which is separated and cloned from fresh tea leaves, its encoding protein in UDP glucose as substrate, and the reaction system in the presence of NADPH in the expression of proteins or by engineering bacteria the recombinant protein UDP can be transformed to UDP glucose, rhamnose. The present invention provides an efficient and safe UDP udp-l-rhamnose biosynthesis technology, using biological engineering method to optimize the reaction conditions of the enzyme, in order to provide the basis for commercial production of UDP udp-l-rhamnose.

【技术实现步骤摘要】
催化UDP-鼠李糖生物合成的基因CsRHMb及其编码蛋白和应用
本专利技术涉及分子生物学及代谢工程学领域，具体地说，涉及一种高效催化UDP-鼠李糖生物合成的基因CsRHMb及其编码蛋白和应用。
技术介绍
茶叶作为一种无酒精饮料广泛被世界各国人民接受和青睐。在茶树中，多酚化合物主要以糖苷化形式存在于茶鲜叶中。而黄酮糖苷是茶树中主要的次生代谢产物，多酚化合物与茶叶品质及人体保健密切相关。其中，黄酮醇及它们的衍生化产物如黄酮醇糖苷是决定茶叶品质和质量的重要组成成分。UDP-鼠李糖作为鼠李糖活化分子的一种重要的化合物，它不仅参与到植物细胞壁合成途径中，而且作为黄酮醇糖苷合成前体物质。例如，芦丁作为一种重要的黄酮醇糖苷，它的含量高低决定了茶汤滋味的好坏。UDP-鼠李糖作为芦丁生物合成所必须的前体物质。UDP-鼠李糖不仅可作为黄酮糖苷生物合成的前体物质，更是多种药用化合物合成必须物质。它在植物细胞壁的形成，化合物合成途径中，科学研究等领域，都有着不可替代的作用。UDP-鼠李糖在植物体内的含量极低，其纯化难度大，效率低等限制该化合物的获得。利用现代化学合成手段也存在诸多问题，例如，合成成本高，过程繁琐，并伴随着污染环境的化学物质产生。因此，采用传统方法很难纯化合成出UDP-鼠李糖。迄今为止，市场上还没有得到商品化的UDP-鼠李糖。而采用生物合成的方式，可以有效避免各种限制因素对UDP-鼠李糖合成的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效催化UDP-鼠李糖生物合成的基因CsRHMb及其编码蛋白和应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术从茶叶鲜叶中分离并克隆获得一种高效催化UDP-鼠李糖生物合成的基因CsRHMb，基因CsRHMb为：i)SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO：1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术还提供由基因CsRHMb编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。基因CsRHMb编码的蛋白在以UDP-葡萄糖为底物，且在NADPH存在的反应体系中，该蛋白或重组蛋白能将UDP-葡萄糖高效转化生成UDP-鼠李糖。本专利技术还提供含有所述基因CsRHMb的表达盒。本专利技术还提供含有所述基因CsRHMb或所述表达盒的载体。优选地，出发载体为pMAL-c2X。本专利技术还提供含有所述基因CsRHMb、所述表达盒或所述载体的工程菌、转基因细胞系。在本专利技术的一个具体实施方式中，将所述基因CsRHMb插入pMAL-c2X载体的多克隆位点中构建得到重组载体pMAL-c2X-CsRHMb，然后将重组载体转化至大肠杆菌Novablue(DE3)中得到携带有基因CsRHMb的重组工程菌。本专利技术还提供由所述基因CsRHMb编码的蛋白，或者携带有所述基因CsRHMb的重组工程菌在催化UDP-葡萄糖合成UDP-鼠李糖中的应用。前述的应用，其是向含有UDP-葡萄糖、NAD和NASPH的反应体系中，加入由所述基因CsRHMb编码的蛋白，或者从所述工程菌中分离纯化的重组蛋白rCsRHMb，通过酶催化反应，生物合成UDP-鼠李糖。总反应体系为50μL：含有3mMUDP-葡萄糖、3mMNAD和3mMNASPH，反应缓冲液为100mM的NaH2PO4/Na2HPO4混合液(pH8.0-10.0，优选pH：9.5)，以及10-20μg由所述基因CsRHMb编码的蛋白，或者所述重组蛋白rCsRHMb。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述重组蛋白rCsRHMb的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。最适酶反应条件为：pH控制在8.0-10.0的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液，反应温度25-45℃。反应时间为1h左右。本专利技术进一步提供由所述高效催化UDP-鼠李糖生物合成的CsRHMb基因编码的蛋白在植物细胞壁形成中的应用。本专利技术提供了一种催化UDP-鼠李糖生物合成的基因及其编码蛋白和应用，首次从茶树中克隆并验证了催化UDP-鼠李糖生物合成的CsRHMb基因，本专利技术还提供了含有CsRHMb基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白。本专利技术提供了一种高效安全的UDP-鼠李糖生物合成技术，利用生物工程方法优化了酶的最适反应条件，为实现UDP-鼠李糖的商品化生产提供了基础。UDP-鼠李糖作为鼠李糖活化分子的一种重要化合物，它不仅参与到植物细胞壁合成途径中，而且作为多种药用物质合成前体物质。例如，可以利用UDP-鼠李糖和糖苷配体为底物，在糖基转移酶酶的催化作用下，生物合成各种糖苷化合物。该类化合物多具有药理活性以及生物活性，已在各个科研领域得到了广泛的认可和利用，为植物的生长发育调控，以及药用化合物的生物合成奠定了坚实基础。附图说明图1为本专利技术实施例1中CsRHMb重组蛋白(rCsRHMb)的SDS-PAGE蛋白电泳分析图；其中，M为蛋白Marker；1为重组质粒诱导前；2为重组质粒诱导后；3为诱导后破碎后上清；4为纯化后重组蛋白rCsRHMb。图2为本专利技术实施例2中HPLC分析rCsRHMb催化的酶活产物结果图；其中，A：底物UDP-葡萄糖标准品；B：以UDP-葡萄糖为底物的死酶对照反应；C：以UDP-葡萄糖为底物的活酶反应；D：用HPLC纯化得到的产物UDP-鼠李糖。图3为本专利技术实施例2中重组蛋白rCsRHMb在不同缓冲液条件下的最适反应pH梯度曲线图。图4为本专利技术实施例2中在最适反应缓冲液和pH条件下，重组蛋白rCsRHMb催化的最适反应温度梯度曲线图。图5为本专利技术实施例2中重组蛋白rCsRHMb催化合成的UDP-鼠李糖产物的核磁二维谱分析；其中，A和B分别为UDP-鼠李糖的二维谱TOCSY和NOESY分析，C为根据氢谱碳谱以及二维谱分析得到的UDP-鼠李糖的结构。图6为本专利技术实施例2中重组蛋白rCsRHMb在体外通过酶反应催化UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖的流程图。图7为重组表达质粒pMal-c2X-CsRHMb的结构图谱。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW，MolecularCloning：aLaboratoryManual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1高效催化UDP-鼠李糖生物合成的基因CsRHMb的克隆及表达一、材料1、茶树品种：农抗早(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze.var.sinensiscultivarNongkangzao)，采集茶树鲜叶，迅速用液氮冷冻，储存于-80℃冰箱中备用；2、大肠杆菌Novablue(DE3)表达宿主菌：购于上海北诺生物科技有限公司；3、LB培养基：称取10gNaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，加入950mL超纯水搅拌溶解，用本文档来自技高网...

【技术保护点】
催化UDP‑鼠李糖生物合成的基因CsRHMb，其特征在于，基因CsRHMb为：i)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQ ID NO：1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.催化UDP-鼠李糖生物合成的基因CsRHMb，其特征在于，基因CsRHMb为：i)SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO：1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.由权利要求1所述基因CsRHMb编码的蛋白。3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。4.含有权利要求1所述基因CsRHMb的表达盒。5.含有权利要求1所述基因CsRHMb或权利要求4所述表达盒的载体。6.含有权利要求1所述基因CsRHMb、权利要求4所述表达盒或权利要求5所述载体的工程菌。7.根据权利要求6所述的工程菌，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高丽萍，代新龙，黄克依，赵贵福，赵月，石渝凤，黎明，夏涛，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34