Wnt5a基因作为猪产仔数性状相关检测的分子标记制造技术

本发明专利技术属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及Wnt5a基因作为猪产仔数性状相关检测的分子标记。所述的分子标记是从猪WNT5A基因中克隆得到。在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的213位的碱基处存在一个A/G的等位基因突变，该突变导致BcgI‑RFLP多态性。本发明专利技术还公开了该分子标记的筛选方法及其在猪辅助选择中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于猪分子标记筛选
，具体涉及Wnt5a基因作为猪产仔数性状相关检测的分子标记。所述的分子标记从猪WNT5A基因中克隆得到，本专利技术还包括猪WNT5A基因3′UTR序列突变位点的检测方法与应用。
技术介绍
母猪产仔数是猪繁殖性状的一个重要指标，是影响养猪业经济效益的重要因素。猪妊娠早期胚胎附植是一个关键步骤，因为在这个过程中胚胎死亡率高(Parketal.,2000)，是导致产仔数下降的一个重要原因(Geisertetal.,2002)因此研究与猪早期胚胎附植相关的基因对于猪产仔数的遗传改良有重要的意义。子宫的容受性和囊胚的植入之间的相互作用在胚胎附植时起关键性作用，在妊娠时子宫要经历形态上、细胞上和分子水平上的变化。子宫的重塑需要转录因子、蛋白同源转化、生长因子、成形素和信号转导分子(Chaetal.,2012)。遗传干扰对这些信号通路的影响可以导致附植失败或者延迟附植，这样对整个妊娠期都有影响，最终导致妊娠失败(Songetal.,2002；Yeetal.,2005；Sunetal.,2012)。Wnt信号通路在器官形成和决定细胞命运中发挥作用(AngersandMoon,2009；MacDonaldetal.,2009；vanAmerongenandNusse,2009)。在经典的信号通路中，Wnt配体结合Fzd和LRP5/LRP6受体来稳定β-catenin发生核异位，然后β-catenin结合到T细胞因子/淋巴增强子结合因子来激活基因的转录。在非经典的Wnt信号通路中，Wnt不依赖β-catenin作为中介物，直接调控细胞移动、细胞形状和细胞极性(Kikuchietal.,2011；vanAmerongenandNusse,2009；Veemanetal.,2003)。Wnt5a基因是一种分泌型糖蛋白，属于高度保守蛋白家族一员，调控许多重要的生物学过程包括决定细胞命运、胚胎发育、细胞增殖、迁移和分化。Wnt5a被认为是非经典Wnt配体，在蟾蜍、斑马鱼和小鼠中敲除Wnt5a后直接影响了细胞运动和极性(Gaoetal.,2011；Miyoshietal.,2012；SchambonyandWedlich,2007；Yamaguchietal.,1999)。目前，研究发现Wnt5a基因在小鼠胚胎附植过程中具有重要作用。用免疫荧光的方法检测到Wnt5a在小鼠妊娠第3天和4天时在子宫内膜上皮细胞和基质中表达，随着附植的发生，在妊娠第5天时基质细胞M侧(附植侧)检测到Wnt5a高表达，第8天时表达量降低(Chaetal.,2014)。这些结果表明Wnt5a在小鼠妊娠第3天和4天时的表达模式与子宫的容受性有关，从而有利于胚胎附植。在Wnt5a敲除小鼠和Wnt5a超表达小鼠的子宫内可以看到没有附植的囊泡，这两种小鼠都存在附植失败和严重的生育问题。鉴于以上研究我们认为Wnt5a基因可能在猪胚胎附植中也发挥着关键性的作用，而对基因突变的多态性位点在群体中的进行关联分析是研究基因功能的一个有力的方法，所以申请人对Wnt5a基因进行了多态性和关联分析，以期为猪的繁殖性状(主要是猪产仔数性状)提供遗传标记资源。
技术实现思路
专利技术的目的在于筛选一种与猪产仔数性状相关的分子标记。本专利技术通过克隆Wnt5a基因3′UTR序列，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪产仔数性状检测提供一种分子标记和方法。本专利技术通过以下技术方案实现：一种与猪产仔数性状相关的分子标记，通过如下步骤筛选得到：(1)根据NCBI数据库里猪Wnt5a基因的cDNA序列(GeneBankAccession：XM_005669658.2)克隆得到Wnt5a基因的部分DNA片段(它的DNA序列如序列表SEQIDNO：1和图2所述。)在序列表SEQIDNO：1的第213位碱基处存在一个A213-G213的碱基突变(等位基因突变)，该突变导致BcgI-RFLP多态性(该突变位于Wnt5a基因3′UTR区域内)。(2)利用双荧光素酶报告实验发现这个突变位点显著影响miR-628-5p与Wnt5a的结合效率，验证这个突变位点是功能性突变位点。一种筛选与猪产仔数性状相关分子标记方法，包括下列步骤：(1)用猪Wnt5a基因的3′UTR序列为模板设计引物；提取猪基因组DNA，设计引物(该引物的核苷酸序列如下所示：正向5′-ATCACACCCTGAGTGTCACG-3′，反向5′-TGTGGAAAGAGGTGTCCTGG-3′)，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。(2)通过分析A/G位点的突变，设计一对用于酶切分析的突变引物(酶切突变引物如下所示：正向5’-GCACACGTGGGTTTGAAGAG-3’，反向5’-TTTAATATAACACTGCAAAATGAAGGCGAGAG-3’)，采用BcgI进行酶切检测多态性，所述的扩增的酶切分型得序列如序列表SEQIDNO：6所示，(3)应用PCR-RFLP的方法对序列表SEQIDNO：1所示的第213位碱基突变进行检测，并初步进行其基因型和猪产仔数性状之间的关联分析。本专利技术为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的标记。更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。附图说明序列表SEQIDNO：1是扩增的Wnt5a基因3′UTR的部分序列(即本专利技术的分子标记)，序列长度为366bp。序列表SEQIDNO：2和3是扩增的Wnt5a基因用于酶切分型的引物对的序列。序列表SEQIDNO：4和5是验证序列表SEQIDNO：1的BcgI-RFLP多态性的突变引物对的序列。序列表SEQIDNO：6是扩增的Wnt5a基因用于酶切分型的核苷酸序列，序列长度为185bp，在该序列的150位碱基处存在一个等位基因突变。图1：本专利技术技术流程图。图2：本专利技术中猪Wnt5a基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段，即本专利技术制备的分子标记(下划线部分为引物，英文字母R代表突变位点，等位基因的突变以(A/G)表示，红色字体为突变引物中突变位点，蓝色字体为保护碱基)。图3：双荧光素酶报告实验结果，SNP显著影响miR-628-5p与Wnt5a的结合效率。图4：本专利技术中Wnt5a基因BcgI-RFLP的三种基因型(AAAGGG)电泳结果。附图标记说明；图中M：DNA分子量标准(markerI，购自宝生物工程大连有限公司)。图5：是本专利技术的分子标记的核苷酸序列图。具体实施方式实施例1Wnt5a基因的克隆(1)引物设计用NCBI里提供的猪Wnt5a基因的3′UTR序列作为参考序列设计引物进行PCR扩增，该引物对的核苷酸序列如下所述：Wnt5a：正向引物：5′-ATCACACCCTGAGTGTCACG-3′反向引物：5′-TGTGGAAAGAGGTGTCCTGG-3′(2)PCR产物的克隆和测序将纯化后的PCR产物与pMD-18T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，在4℃水浴过夜连接；无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5mlEpendorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，冰浴3-4min，加入400μl无抗生素的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与猪产仔数性状相关的分子标记，其核苷酸序列如下所示：ATCACACCCTGAGTGTCACGAAGTAGCCTTGTTTCTGAGGAATCTGGAAGGTCTTACTGATATGCACACGTGGGTTTGAAGAGTTCTTTTATCGACCCTGCCCCATCCGCTGTTCTCCAGCCTCCTTCCCTGTACCCTTCTGGACAGGGCATTACTTGTTCATCAGAGACATGGGAATGAAGAGACAGTCAACACTTGAAAGCATTGTCAGCRTTTCTCTTCCCTTCATTTTGCAGTGTGGAAACTGGTGCCCATTAGATCTGATAGTACTTATTTGAGTCCCCAGGGAAAATCCTGCTCACGACATATCTAGCTAGTTTTGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACCAGGACACCTCTTTCCACA上述序列中的R是A或T，该突变导致BcgI‑RFLP多态性。

【技术特征摘要】
1.一种与猪产仔数性状相关的分子标记，其核苷酸序列如下所示：ATCACACCCTGAGTGTCACGAAGTAGCCTTGTTTCTGAGGAATCTGGAAGGTCTTACTGATATGCACACGTGGGTTTGAAGAGTTCTTTTATCGACCCTGCCCCATCCGCTGTTCTCCAGCCTCCTTCCCTGTACCCTTCTGGACAGGGCATTACTTGTTCATCAGAGACATGGGAATGAAGAGACAGTCAACACTTGAAAGCATTGTCAGCRTTTCTCTTCCCTTCATTTTGCAGTGTGGAAACTGGTGCCCATTAGATCTGATAGTACTTATTTGAGTCCCCAGGGAAAATCCTGCTCACGACATATCTAGCTAGTTTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：余梅，王敏，邓大栋，刘榜，李小平，李新云，朱猛进，赵书红，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42