本发明专利技术涉及一种抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗，是从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophilin基因，再通过克隆、诱导表达、纯化获得的疫苗，其保藏号为：CCTCC M2015426。本发明专利技术还涉及rEg.myophilin基因分子应用于制备抗绵羊包虫病感染的疫苗。本发明专利技术在细粒棘球蚴重组疫苗myophilin在绵羊身上进行免疫保护验证，免疫保护力达到了92％。该疫苗有望在肝包虫防治中发挥巨大的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，设及抗绵羊包虫病感染的基因巧g.myophilin分 子工程疫苗、其制备方法及应用技术
技术介绍
细粒棘球蝴虫病，俗称包虫病，目前尚没有商品化的疫苗。当前已有十余种候选分 子，如Eg95、rEgl4-3-3重组疫苗、铁蛋白重组疫苗、GST重组疫苗等，其中最早证实EG95是 一种绵羊保护性细粒棘球蝴疫苗，其对绵羊的保护力为96-98%，其中国内康强等也在绵羊 身上对EG95进行保护力验证，得到了 90 %的保护力。遗憾的是Eg95首先由国外研发成功 的，即使开发成为真正的商品，其知识产权也不属于我们。而目前绝大部分包虫病候选疫苗 分子都是通过小鼠继发感染实验完成，缺乏直接的应用价值，因为包虫感染主要通过其虫 卵经消化道感染而不是继发感染；再者，小鼠亦不是细粒棘球蝴病（包虫病）主要的天然适 宜宿主。 由于细粒棘球蝴主要寄生于人的肝脏，故该病又称为肝包虫病。它呈世界性分布， 是全球性的公共卫生问题。据近年普查，我国有25个省、市和自治区有该病的病例报道，其 中W新疆、宁夏、甘肃、青海、西藏、四川、内蒙古7个省（区）流行最为严重，高发区约占全 国面积的44%，受威胁人口约5千万。该病已被列为我国重点防治的寄生虫病之一。 包虫病严重危害人类的健康和农牧业经济的发展。包虫病对人危害主要表现为在 肝脏、肺、脑或肾等器官形成占位性包囊病变，W机械压迫与营养消耗等形式造成运些重 要器官的严重损害，甚至导致个体死亡；而对于家畜而言，包虫病将会造成家畜的减产、品 质下降等重大经济问题，并且作为寄生虫感染生活史的重要一个环节对人民生命财产安全 带来巨大隐患。 目前，人包虫病的首选治疗方法是外科手术，但由于该病发病早期可无自觉症状， 等到入院就诊时，相应的脏器已经受到严重的损伤并且手术本身对机体也有损伤，从而使 患者在健康和经济上都蒙受了极大的损害。对于较早期小棘球蝴或有手术禁忌的病例可采 用阿苯化挫或甲苯咪挫等药物进行化疗，临床发现运些药物存在严重的毒副作用，部分患 者不能耐受，同时某些化疗患者可产生耐药性。因此，无论是手术治疗，还是药物治疗，对于 包虫病治疗都有很大的不足。对于家畜而言，目前很少有相应的诊疗措施。 要想从源头上防控包虫病，疫苗的研发将是必然选择。近年来，随着分子生物学技 术的迅速发展及在医学科学中的广泛应用，利用基因工程技术对病原体进行分子疫苗的预 防研究引起了人们的广泛关注。从目前的研究情况来看，国内外对细胞粒棘球蝴虫研究较 为成功的重组疫苗有Eg95,它已在人工感染的牛和羊群获得了较好的免疫保护水平，免疫 保护力达到96-98%。 羊作为细粒棘球缘虫最主要的天然中间宿主，是细粒棘球蝴缘虫感染生活史的重 要环节，制备出羊的包虫病疫苗，预防家畜羊的感染，阻断寄生虫生活史进而减少传染给人 的几率，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对目前没有羊包虫病疫苗的现状，提供一种基因 分子巧g.myophilin在制备抗绵羊包虫病感染疫苗上的应用，同时提供运种疫苗及其制备 方法。 阳009] 本专利技术技术方案如下： 阳010] 抗绵羊包虫病感染的基因巧g.myophilin分子工程疫苗，是从细粒棘球蝴中国株 提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophilin基因，再通过克隆、诱导表达、纯化获得的疫苗， 其保藏号为：CCTCCM2015426。 -种抗绵羊包虫病感染的基因巧g. myophilin分子工程疫苗的制备方法，首先从 细粒棘球蝴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg. myophi 1 in基因，该基因收录在GenBank 数据库，序列号：DQ679473,Eg. myophilin亚克隆于表达载体祀T-28a，再转化到大肠杆菌 化21 0E3) PlysS中诱导表达，再用含Ni化的His-bind树脂纯化试剂盒纯化蛋白； 巧g.myophilin基因分子应用于制备抗绵羊包虫病感染的疫苗。 本专利技术在细粒棘球蝴重组疫苗myophilin在小鼠身上进行免疫保护验证，免疫保 护力达到了 92%。该疫苗有望在肝包虫防治中发挥巨大的作用。【附图说明】 图1显示采用ELISA法分别检测了血清中巧g.myophilin抗原特异性IgGJgGU IgG2与I姐抗体水平。 阳01引图2显示ELISA细胞因子试剂盒检测结果，疫苗组IFN-丫与比-2显著升高，表明 Thl型介导的细胞免疫应答显著激活；而与化2型细胞因子IL-4亦显著升高，表明体液免 疫应答亦明显上调，与抗体升高结果一致。【具体实施方式】 疫苗制备： 阳017] -种抗绵羊包虫病感染的基因巧g. myophilin分子工程疫苗的制备方法，首先从 细粒棘球蝴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg. myophi 1 in基因，该基因收录在GenBank数据库，序列号：DQ679473,Eg. myophilin亚克隆于表达载体祀T-28a，再转化到大肠杆菌 化21 0E3) plysS中诱导表达，再用Novagen公司的含Ni化的His-bind树脂纯化试剂盒纯 化蛋白； 为了证实重组抗原疫苗巧g.myophilin的抗包虫病感染的免疫保护力，本专利技术W 绵羊天然感染包虫虫卵为基础，通过初次免疫-加强免疫（prime-boost)进行预防接种 巧g.myophilin,采用分子生物学、细胞生物学、免疫学等手段，评价该疫苗抗包虫感染的保 护力及其免疫保护机制。 1、实验动物与细粒棘球虫卵的准备 4-6月龄雄性绵羊，利用原头蝴粗抗原包被检测绵羊血清巧LISA)阴性的入组，随 机分为3组：疫苗巧g.myophilin接种组、FCA(完全福氏佐剂）组、PBS组，每组10只。细 粒棘球缘虫虫卵由兰州兽医所提供，具体制备过程如下：从新疆购买6月龄±犬3只，于兰 州兽医所试验站隔离饲养，用化哇酬对实验犬进行驱虫，并注射地塞米松W降低其免疫力。 一周后，给实验犬喂食含有原头蝴的包囊，感染后45d对其进行粪便检测，粪便细粒棘球缘 虫虫卵阳性时，注射乌拉坦安乐处死（实验犬于处死之前禁食2地，W减少小肠内容物），沿 腹中线剖开腹部，自幽口至小肠下段结扎，剪下小肠，分离肠系膜，将其纵向剪成大小适宜 的片段4-5段，放在含有37°C生理盐水的小烧杯中稍微晃动W洗掉其内容物，再次更换新 的生理盐水，将其放在水浴锅中37°C解育比，使细粒棘球缘虫成虫从小肠肠壁自行脱落。 用注射器将细粒棘球缘虫虫体吸出，滴数滴于载玻片上，在显微镜下检测并判断其是否成 熟，收集成熟的细粒棘球缘虫虫体于生理盐水中，用注射器吸取，每管吸取20个成熟虫体， 保存备用，用于实验绵羊包虫病的人工感染。（细粒棘球缘虫虫卵获取的整个实验过程中， 操作人员均穿戴一次性防护服，实验完后对隔离的实验犬舍地面及周围喷洒碱石灰糊状 液（1:4)，并对整个实验过程中用到的所有实验器材喷洒10.0%次氯酸钢溶液W杀灭有可 能残留的细粒棘球缘虫虫卵，另外，实验过程中用到的一次性防护用品全部销毁，W消除对 周围环境的污染。） 2、免疫接种与细粒棘球虫卵感染 分别在第1周与第4周免疫接种绵羊。疫苗过滤除菌，用PBS调节浓度至50yg/ ml,颈部注射Iml的疫苗本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗，是从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT‑PCR获得Eg.myophilin基因，再通过克隆、诱导表达、纯化获得的疫苗，其保藏号为：CCTCC M2015426。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵巍，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：宁夏;64
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