杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇制造技术

一种生物技术领域的杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇，包括12个基因的核苷酸序列或由序列1形成的互补序列，其中：负责合成碳骨架共六个基因：pieA1，pieA2，pieA3，pieA4，pieA5，pieA6；负责吡啶环形成共两个基因：pieC，pieD；负责对生物合成进行调控一个基因：pieR；负责后修饰过程共三个基因：pieB1，pieB2，pieE。本发明专利技术提供了杀粉蝶菌素A1生物合成相关的基因信息，为杀粉蝶菌素A1生物合成的研究及其遗传改造提供了基础；本发明专利技术的杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇可广泛用于农业、工业和医药领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物
的基因簇，具体涉及的是一种具有抗真菌，杀粉蝶等农业害虫及抗肿瘤的活性的抗生素-杀粉蝶菌素Al (Piericidin Al)生物合成基因簇。
技术介绍
PiericidinAl 由票霄素链霄菌杭州湾变种(Streptomyces piomogeues var. hangzhouwanensis)发酵产生的一种吡啶环(pyridone)类抗生素。吡啶环类抗生素是一类具有特定结构的微生物天然产物，此类抗生素由于与辅酶Q结构相似，故可以竞争性阻断电子从NADH到辅酶Q的传递，抑制线粒体呼吸作用，从而影响生物体正常代谢过程。研究证实杀粉蝶菌素Al对微生物、植物致病菌显示较弱的抗菌活性，但是对致病真菌显示较强的生物活性，例如对新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的最低抑菌浓度仅为2 μ g/ml，对红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的最低抑菌浓度为10 μ g/ml。对粉蝶、蚕、菜青虫有很显著的杀虫效果，其中当浓度为4. 8 μ g/ml时就可以使二龄家蚕幼虫死亡率达到100%，曾经作为杀虫剂进行开发研究，但由于其具有生物毒性，存在不可忽视的残留问题，故影响广泛推广使用。此外，它还是白介素2(interleUkin-2)的抑制剂，而白介素2是一种广泛存在的免疫反应调控者，白介素2过量表达与一些肿瘤，自身免疫类疾病， 器官移植排斥反应等相关，从而可作为治疗这些病症的潜力药物。另一方面，杀粉蝶菌素Al 对脊椎动物也有很强的毒性，实验证明，它对老鼠的口服急性毒性为3. :3mg/kg，按照我国相关规定属于高毒药品。关于杀粉蝶菌素Al的生物合成途径至今尚未阐明，根据结构推测其由典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由一个丙二酰辅酶A的起始单元，三个丙二酰辅酶A的延伸单元和五个甲基丙二酰辅酶A的延伸单元进行组装形成碳骨架，然后经过天冬酰氨合酶，环化酶完成转氨成环反应形成吡啶环，最后经过氧化还原酶，甲基转移酶对其进行后修饰，形成了最终产物。杀粉蝶菌素Al的生物活性与其结构密切相关，随着杀粉蝶菌素Al整个生物合成基因簇的克隆与功能分析，可以从分子水平上阐明杀粉蝶菌素Al独特的生物合成机理， 在此基础上运用代谢工程的原理，合理修饰杀粉蝶菌素Al的生物合成途径，探索生物利用度高，生物毒性更小的非天然的天然产物。经对现有技术的文献检索发现，尚未见到有关于杀粉蝶菌素Al生物合成基因簇的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，公开杀粉蝶菌素Al的生物合成基因族，本专利技术包括由链霉菌Streptomyces piomogeues var. hangzhouwanensis产生的具有良好生物活性的抗生素杀粉蝶菌素Al的生物合成基因簇的克隆、测序、分析，为生物合成杀粉蝶菌素Al及其遗传改造提供了基础。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术涉及一种杀粉蝶菌素Al生物合成基因簇，其序列如序列1所示。包括12个基因的核苷酸序列或由序列1形成的互补序列，其中负责合成碳骨架共六个基因=PieAl, pieA2，pieA3，pieA4，pieA5，pieA6，；负责吡啶环形成共两个基因pieC，pieD ；负责对生物合成进行调控一个基因pieR ；负责后修饰过程共三个基因 pieBl, pieB2, pieE。所述基因pieAl，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列3中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第1152 8837位；所述基因pieA2，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列4中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第8883 19019位；所述基因pieA3，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列5中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第19078 24250位；所述基因pieA4，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列6中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第24374 30808位；所述基因pieA5，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列7中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第30858 36479位；所述基因pieA6，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列8中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第36391 436 位；所述基因pieC，编码环化酶，由序列10中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第44470 44982位；所述基因pieD，编码天冬酰氨合酶，由序列11中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第45109 46869位；所述基因pieR，编码转录调节蛋白，由序列2中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第1 600位；所述基因pieBl，编码甲基转移酶，由序列9中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第43672 44358位；所述基因pieB2，编码甲基转移酶，由序列12中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第46881 476 位；所述基因pieE，编码黄素单加氧酶，由序列13中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第47657 49417位。所述的序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列通过聚合酶链式反应或用限制性内切酶酶切DNA得到。所述的核苷酸序列或部分核苷酸序列，利用聚合酶链式反应的方法或以上序列的 DNA作为探针进行Southern杂交或者碱基序列合成的方法得到杀粉蝶菌素Al生物合成基因的同源基因。所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段通过打断杀粉蝶菌素 Al生物合成的一个或几个结构基因而得到杀粉蝶菌素Al衍生物。所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段通过打断杀粉蝶菌素 Al生物合成的一个或几个修饰基因而得到新的杀粉蝶菌素Al衍生物。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果利用本专利技术的基因簇可实现以下目的本专利技术所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本专利技术序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法从其他微生物中得到杀粉蝶菌素Al生物合成基因的同源基因。本专利技术所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从 Streptomyces piomogeues var. hangzhouwanensis基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本专利技术中的部分序列，也包含有基因组中以前临近区域未克隆的DNA。本专利技术所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断杀粉蝶菌素Al生物合成的一个或几个步骤或者引入其他同源基因而得到新的杀粉蝶菌素Al的前体或衍生物。本专利技术所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以用来提高杀粉蝶菌素Al或其衍生物的产量。例如，转入更多拷贝的正调节基因或增强其表达。本专利技术所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。本专利技术所提供的序列或部分序列的克隆基因可以通过合适的表达系本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种杀粉蝶菌素Ａ１生物合成基因簇，其特征在于，包括１２个基因的核苷酸序列或由序列１形成的互补序列，其中：负责合成碳骨架共六个基因：ｐｉｅＡ１，ｐｉｅＡ２，ｐｉｅＡ３，ｐｉｅＡ４，ｐｉｅＡ５，ｐｉｅＡ６，；负责吡啶环形成共两个基因：ｐｉｅＣ，ｐｉｅＤ；负责对生物合成进行调控一个基因：ｐｉｅＲ负责后修饰过程共三个基因：ｐｉｅＢ１，ｐｉｅＢ２，ｐｉｅＥ。

【技术特征摘要】
1.一种杀粉蝶菌素Al生物合成基因簇，其特征在于，包括12个基因的核苷酸序列或由序列1形成的互补序列，其中负责合成碳骨架共六个基因pieAl，pieA2，pieA3，pieA4， pieA5, pieA6,；负责吡啶环形成共两个基因pieC，pieD ；负责对生物合成进行调控一个基因pieR负责后修饰过程共三个基因pieBl，pieB2, pieE。2.根据权利要求1所述的杀粉蝶菌素Al生物合成基因簇，其特征是所述基因pieAl，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列3中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第1152 8837位；所述基因pieA2，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列4中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第8883 19019位；所述基因pieA3，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列5中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第19078 24250位；所述基因pieA4，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列6中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第24374 30808位；所述基因pieA5，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列7中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第30858 36479位；所述基因pieA6，编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列8中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第36391 436 位；所述基因pieC，编码环化酶，由序列10中的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列1中第44470...

【专利技术属性】
技术研发人员：由德林，刘倩，孙东昌，吴吉安，施跃峰，邓子新，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31