本发明专利技术公开了一种基于巴氏杜氏藻代谢途径的β-胡萝卜素工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)从巴氏杜氏藻中获取相关基因的cDNA；(2)巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的获取；(3)p15A复制起始位点和氯霉素抗性基因的获取；(4)构建质粒pDbcrtB，质粒pDbcrtB转化大肠杆菌DH5α后获得β-胡萝卜素工程菌。该菌株呈橙黄色，利用巴氏杜氏藻的八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、ζ-胡萝卜素脱氢酶和番茄红素β环化酶来合成β-胡萝卜素。该菌株在2YT培养基下37℃摇瓶培养24小时的β-胡萝卜素的产率为2.7～3.4mg/g(细胞干重)。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于巴氏杜氏藻代谢途径的β -胡萝卜素工程菌和构建方法，具体地说涉及从巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)中钓取八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢酶(Pds)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)、番茄红素β环化酶(LycB)等基因的cDNA并构建出高产β-胡萝卜素的工程菌。
技术介绍
类胡萝卜素是具有共轭聚烯结构的一类物质。在医学上，类胡萝卜素具有预防和治疗心血管疾病、白内障以及某些癌症等功能。此外，类胡萝卜素也被广泛应用于动物饲料、食物和化妆品中。营养保健、医药、食品以及化妆品上的广泛应用使得类胡萝卜素在世界范围内有着较高的需求量。世界卫生组织调查发现，世界范围内因维生素A缺乏而受到失明甚至死亡威胁的学龄前儿童高达1.4 2. 5亿人。维生素A原类胡萝卜素特别是β-胡萝卜素的充足提供是解决当前难题的关键。据市场研究机构调查显示，2004年的类胡萝卜素的市场销售总额为8. 869亿美元，到2009年它将突破10亿美元。巴氏杜氏藻(Eukaryota 总界、Viridiplantae 界、Chlorophyta 门、Chlorophyceae 纲、Chlamydomonadales 目、 Dunaliellaceae科、Dunaliella属)在应激条件下能够大量积累β -胡萝卜素，其含量最高可超过干重的10%。因此，从分子生物学角度构建带杜氏藻类胡萝卜素合成基因的高产工程菌株有着重大的社会和经济意义。分子生物学分析显示，类胡萝卜素途径的酶是单一的基因产物，它们催化特定的反应。从番茄红素到玉米黄素或者α-胡萝卜素不需要所有酶一齐起作用。此外，不同的酶组合形成的途径产生各种各样的类胡萝卜素。因此，利用杜氏藻类胡萝卜素途径的相关基因通过相关基因工程手段来构建类胡萝卜素高产菌株对提供类胡萝卜素的产量具有根本上的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于巴氏杜氏藻代谢途径构建的胡萝卜素工程菌及构建方法。本专利技术通过本研究利用相关基因工程手段钓取巴氏杜氏藻类胡萝卜素合成途径的八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢酶(Pds)、ζ-胡萝卜素脱氢酶 (Zds)、番茄红素β环化酶(LycB)等基因的cDNA，并利用ρ15Α复制起始位点，氯霉素抗性基因以及巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子构建出质粒pDbcrtB。转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 α (Bacteria 总界、Proteobacteria 门、GammaproteobacteriaEnterobacteriales 巨、Enterobacteriaceae Escherichia M^ Escherichia coli 种)(细菌呈白色)后获得一种呈橙黄色的胡萝卜素高产工程菌Escherichia coli DH5a (pDbcrtB)，它利用了巴氏杜氏藻的八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、 ζ -胡萝卜素脱氢酶和番茄红素β环化酶来合成β _胡萝卜素。本专利技术的目的通过以下技术方案实现基于巴氏杜氏藻代谢途径的β -胡萝卜素工程菌的构建方法，包括如下步骤(1)相关基因的cDNA获取从对数生长期的巴氏杜氏藻中提取总RNA，利用M-MLV反转录酶以18个T的寡聚核苷酸为引物进行反转录获得巴氏杜氏藻的总cDNA ；以巴氏杜氏藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物Pl :5， -CCGCTCGAGATGGCACAGCGAACAGCAAC-3，和下游引物 P2 5，-CCATCGATGGGACGCGTTTATTTGTTCT TGGGCAC-3’进行PCR扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy基因的cDNA ；以巴氏杜氏藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P3 :5， -CGACGCGTATGCAGGTTATGCAGGGCAGG-3，和下游引物P4 :5，-CCATCGATGATCGATCGTTAGAACCAAG GGAAGG-3’进行PCR扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的cDNA ；以巴氏杜氏藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P5 :5， -ATCGATCGATGTTGGGGCTGCACAGCAAGG-3，和下游引物P6 :5，-CCATCGATGGGCTTAAGTTACATGCTC GGAAGTG-3’进行PCR扩增得到巴氏杜氏藻ζ -胡萝卜素脱氢酶Zds基因的cDNA ；以巴氏杜氏藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P7 :5， -GGGCTTAAGATGCAGGCCCTGCAGCAACAC-3，和下游引物P8 :5，-CCATCGATTCAACTTTTTTGTCCTTGC GTCAC-3，进行PCR扩增得到巴氏杜氏藻番茄红素β环化酶LycB基因的cDNA;(2)巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的获取从对数生长期的巴氏杜氏藻中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶，以上游引物 P9 :5，-GGTGACACTATAGGGGAAAGCTTGCATGCCTGC-3， 和下游引物 PlO :5，-CCATCGATCCGCTCGAGCCTACACACAGAGGAAG-3，进行 PCR 扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子；(3)pl5A复制起始位点和氯霉素抗性基因的获取依次用内切酶Cla I在30°C下和Hind III在37°C下对质粒pVA838处理Ih后，纯化并回收DNA片段；利用T4 DNA聚合酶对获取的DNA片段进行平末端化，纯化并回收DNA产物，利用T4 DNA连接酶使DNA自身环化为质粒pcmpl5A，质粒pcmpl5A转化大肠杆菌DH5 α 进行增殖；(4)质粒的构建纯化后的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子DNA片段在T4DNA连接酶作用下与经纯化和碱性磷酸酶处理过的质粒pcmpl5A的DNA片段进行连接，获得质粒pDbA ； 依次用内切酶Xho I在37°C下和Cla I在30°C下对质粒pDbA和纯化后的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy基因的cDNA处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒pDbB ；依次用内切酶Mlu I在37°C下和Cla I在30°C下对质粒pDbB和纯化后的巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的cDNA处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒pDbC ；依次用内切酶Pvu I在37°C下和Cla I在30°C下对质粒pDbC和纯化后的巴氏杜氏藻ζ _胡萝卜素脱氢酶Zds基因的cDNA处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒pDbcrtA ；依次用内切酶Afl II在37°C下和Cla I在30°C下对质粒pDbcrtA和纯化后的巴氏杜氏藻番茄红素β环化酶LycB基因的cDNA处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在 T4 DNA连接酶作用下形成质粒pDbcrtB ；质粒pDbcrtB本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．基于巴氏杜氏藻代谢途径的β－胡萝卜素工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（１）相关基因的ｃＤＮＡ获取从对数生长期的巴氏杜氏藻中提取总ＲＮＡ，利用Ｍ－ＭＬＶ反转录酶以１８个Ｔ的寡聚核苷酸为引物进行反转录获得巴氏杜氏藻的总ｃＤＮＡ；以巴氏杜氏藻总ｃＤＮＡ为模板，利用ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ聚合酶，以上游引物Ｐ１：５’－ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＣＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣ－３’和下游引物Ｐ２：５’－ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＣ－３’进行ＰＣＲ扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Ｐｓｙ基因的ｃＤＮＡ；以巴氏杜氏藻总ｃＤＮＡ为模板，利用ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ聚合酶，以上游引物Ｐ３：５’－ＣＧＡＣＧＣＧＴＡＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＧ－３’和下游引物Ｐ４：５’－ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＴＴＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＧＡＡＧＧ－３’进行ＰＣＲ扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶Ｐｄｓ基因的ｃＤＮＡ；以巴氏杜氏藻总ｃＤＮＡ为模板，利用ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ聚合酶，以上游引物Ｐ５：５’－ＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＧＧ－３’和下游引物Ｐ６：５’－ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＧＣＴＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＣＴＣＧＧＡＡＧＴＧ－３’进行ＰＣＲ扩增得到巴氏杜氏藻ζ－胡萝卜素脱氢酶Ｚｄｓ基因的ｃＤＮＡ；以巴氏杜氏藻总ｃＤＮＡ为模板，利用ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ聚合酶，以上游引物Ｐ７：５’－ＧＧＧＣＴＴＡＡＧＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡＣ－３’和下游引物Ｐ８：５’－ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＧＣＧＴＣＡＣ－３’进行ＰＣＲ扩增得到巴氏杜氏藻番茄红素β环化酶ＬｙｃＢ基因的ｃＤＮＡ；（２）巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Ｐｓｙ启动子的获取从对数生长期的巴氏杜氏藻中提取基因组ＤＮＡ，以基因组ＤＮＡ为模板，利用ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳ ＤＮＡ聚合酶，以上游引物Ｐ９：５’－ＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣ－３’和下游引物Ｐ１０：５’－ＣＣＡＴＣＧＡＴＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧ－３’进行ＰＣＲ扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Ｐｓｙ启动子；（３）ｐ１５Ａ复制起始位点和氯霉素抗性基因的获取依次用内切酶Ｃｌａ Ｉ在３０℃下和Ｈｉｎｄ ＩＩＩ在３７℃下对质粒ｐＶＡ８３８处理１ｈ后，纯化并回收ＤＮＡ片段；利用Ｔ４ ＤＮＡ聚合酶对获取的ＤＮＡ片段进行平末端化，纯化并回收ＤＮＡ产物，利用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶使ＤＮＡ自身环化为质粒ｐｃｍｐ１５Ａ，质粒ｐｃｍｐ１５Ａ转化大肠杆菌ＤＨ５α进行增殖；（４）质粒的构建纯化后的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Ｐｓｙ启动子ＤＮＡ片段在Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用下与经纯化和碱性磷酸酶处理过的质粒ｐｃｍｐ１５Ａ的ＤＮＡ片段进行连接，获得质粒ｐＤｂＡ；依次用内切酶Ｘｈｏ Ｉ在３７℃下和Ｃｌａ Ｉ在３０℃下对质粒ｐＤｂＡ和纯化后的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Ｐｓｙ基因的ｃＤＮＡ处理１ｈ，纯化并回收ＤＮＡ片段；接着两者在Ｔ４ ＤＮＡ连接酶作用下形成质粒ｐＤｂＢ；依次用内切酶Ｍｌｕ Ｉ在３７℃下和Ｃｌａ Ｉ在３０℃下对质粒ｐＤｂＢ和纯化后的巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶Ｐｄｓ基因的ｃＤＮＡ处理１ｈ，纯化并回收ＤＮＡ片段；接着两者在Ｔ４ ＤＮＡ连接酶作用下形成质粒ｐＤｂＣ；依次用内切酶Ｐｖｕ Ｉ在３７℃下和Ｃｌａ Ｉ在３０℃下对质粒ｐＤｂＣ和纯化后的巴氏杜氏藻ζ－胡萝卜素脱氢酶Ｚｄｓ基因的ｃＤＮＡ处理１ｈ，纯化并回收ＤＮＡ片段；接着两者在Ｔ４ ＤＮＡ连接酶作用下形成质粒ｐＤｂｃｒｔＡ；依次用内切酶Ａｆｌ ＩＩ在３７℃下和Ｃｌａ Ｉ在３０℃下对质粒ｐＤｂｃｒｔＡ和纯化后的巴氏杜氏藻番茄红素β环化酶ＬｙｃＢ基因的ｃＤＮＡ处理１ｈ，纯化并回收ＤＮＡ片段；接着两者在Ｔ４ ＤＮＡ连接酶作用下形成质粒ｐＤｂｃｒｔＢ；质粒ｐＤｂｃｒｔＢ转化大肠杆菌ＤＨ５α后获得β－胡萝卜素工程菌。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜建国，叶志伟，劳永民，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：81
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