【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶的基因工程，具体地说涉及利用分子生物学技术获得一种催化活力显著提高的脂肪酸amp连接酶突变体及其大肠杆菌重组表达制备方法。
技术介绍
1、脂肪酸amp连接酶(faal，ec 6.2.1.20)隶属于腺苷酸形成超家族。该家族的酶主要以脂肪酸作为羧酸底物，利用atp使羧基腺苷酸化。针对反应过程中atp价格昂贵的问题，目前已经开发出atp自循环生成系统，成功解决atp再生的问题，有效降低催化反应的成本，为实现该酶的产业化奠定了重要基础。目前，有关于脂肪酸amp连接酶的专利仅有两篇(cn109765379 b，cn 105779400 a)，主要是利用其作为诊断抗原及催化癸酸的磷酸化作用，应用于达托霉素的生产。更为重要的是，现已报道的脂肪酸amp连接酶酶活力都普遍较低，限制了其应用。
技术实现思路
1、本专利技术在前期对来源于柠檬交替假单胞菌的脂肪酸amp连接酶酶学性质表征的基础上，尝试采用基于结构的理性设计方法，通对酶催化活性中心中与底物结合相关氨基酸进行能量计算、理性筛选和突变设计，从中挑选出候选突变位点及所突变的氨基酸类型，并在此基础上，开展实验验证，对效果较好的突变体进一步进行叠加突变，观察不同位点在提升酶蛋白活力方面的协同效果，最终改造获得了在保持酶蛋白稳定性不变情况下，酶活力显著提高的突变体，为该酶的下游应用奠定基础。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种来源于柠檬交替假单胞菌的脂肪酸amp连接酶突变体，是在氨基酸序列seqid no
4、优选地，所述的突变体在如seq id no.1所示氨基酸序列基础上，至少经过如下任意一种氨基酸突变得到：f211a、f211g(氨基酸序列如seq id no.2所示)、h213g、y244a、y244g、t272i、f304a、f304g、m344a。
5、优选地，所述突变体为如下任意一种组合：f211a-h213a、f211a-y244g、f211a-f304a、l343a-m344a、f211a-l343a-m344a以及y244g-l343a-m344a。
6、一种编码所述脂肪酸amp连接酶突变体的基因，其核苷酸序列如seq id no.3-17所示。
7、一种含上述基因的重组基因工程菌。所述工程菌的制备方法：将权利要求4或5所述基因克隆到表达载体pet28a上，转化大肠杆菌感受态细胞，获得重组基因工程菌。
8、优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌arctic express(de3)。
9、所述的重组基因工程菌的发酵方法，所用发酵培养基为tb培养基，诱导条件为添加终浓度为0.5±0.3mm的iptg，诱导温度18±3℃，诱导时间20±5h。
10、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
11、本专利技术所构建的突变体相比于野生型酶蛋白，在保持其酶蛋白稳定性不变情况下，酶活力可提高到原来的2.0-3.5倍，为该酶的下游应用奠定基础。
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1.一种脂肪酸AMP连接酶突变体，其特征在于，所述的突变体在如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列基础上，至少经过如下任意一种氨基酸突变得到：F211A、F211G、H213G、Y244A、Y244G、T272I、F304A、F304G、M344A。
2.根据权利要求1所述的脂肪酸AMP连接酶突变体，其特征在于，所述突变体为如下任意一种组合：F211A-H213A、F211A-Y244G、F211A-F304A、L343A-M344A、F211A-L343A-M344A以及Y244G-L343A-M344A。
3.一种编码权利要求1或2所述脂肪酸AMP连接酶突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3-17所示任意一种。
5.一种含权利要求3或4所述基因的重组基因工程菌。
6.根据权利要求5所述重组基因工程菌，其特征在于，所述工程菌的制备方法：将权利要求3或4所述基因克隆到表达载体pET28a上，转化大肠杆菌感受态细胞，获得重组基因工程菌。
7.根据权利要求5
8.权利要求5或6或7所述的重组基因工程菌的发酵方法，其特征在于，所用发酵培养基为TB培养基，诱导条件为添加终浓度为0.5±0.3mM的IPTG，诱导温度18±3℃，诱导时间20±5h。
...【技术特征摘要】
1.一种脂肪酸amp连接酶突变体，其特征在于，所述的突变体在如seq id no.1所示氨基酸序列基础上，至少经过如下任意一种氨基酸突变得到：f211a、f211g、h213g、y244a、y244g、t272i、f304a、f304g、m344a。
2.根据权利要求1所述的脂肪酸amp连接酶突变体，其特征在于，所述突变体为如下任意一种组合：f211a-h213a、f211a-y244g、f211a-f304a、l343a-m344a、f211a-l343a-m344a以及y244g-l343a-m344a。
3.一种编码权利要求1或2所述脂肪酸amp连接酶突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：王方华，李可妍，邓富莉，王永华，蓝东明，杨博，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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