【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及通过将dna质粒和其他载体非内吞的递送至供体细胞中来制备治疗性细胞外囊泡(ev)，特别是外泌体的方法，所述ev包含功能性信使rna(mrna)、microrna(mir)、短发夹rna(shrna)、蛋白质和其他生物分子，其方式是由递送引起的强烈刺激触发供体细胞在细胞内产生大量的囊泡，而dna质粒和载体的非内吞递送会引起细胞质内快速rna转录和蛋白质翻译，使这些功能性生物分子在作为ev从供体细胞分泌出来前内源性地封装在囊泡中。
技术介绍
1、细胞外囊泡(extracellular vesicle，ev)包括外泌体、微囊泡和其他囊泡，可由多种细胞分泌。在人体中，1ml血液中有>10e12个ev，它们也存在于其他体液中。外泌体为一种纳米囊泡(40-150nm)，而微囊泡的大小为<100nm至>1微米不等。它们包含编码和非编码rna及其片段、dna片段、蛋白质和其他与细胞有关的生物分子。ev及它们的生物分子内容物已被提出作为疾病诊断的生物标记。此外，它们对于肿瘤微环境和循环中的细胞间通讯也具有重要意义。
2、载有功能性rna和蛋白质的ev也被提出用于治疗用途的药物和药物载体。为了能在体外和体内将特异性核酸和/或蛋白质递送至靶组织或细胞类型中，需要能够制备具有内源性或外源性治疗性货物(cargo)ev的方法。
3、近年来，已开发了通过常规的批量电穿孔(bep)将外源小干扰rna(sirna)和shrna质粒后插入预先存在的外泌体中。尽管已在几种癌症和非癌症疾病的小鼠模型中成功证明了
4、如果可以开发出可以用dna质粒或其他载体转染供体细胞以内源性地产生大量含有治疗性rna和蛋白质靶标的外泌体或其他ev的新方法是十分理想的。
5、在早先的美国专利申请14/282630中，我们开发了一种纳米通道电穿孔(nep)生物芯片，该芯片可通过优良的剂量管控将dna质粒或其他带电粒子和分子非内吞地递送至单个细胞中。在此，我们证明了nep可以产生大量含有高拷贝的功能性mrna和microrna靶标的治疗性外泌体，而此通过上述后插入法是无法实现。除nep以外，其他非内吞的递送方法(如基因枪、微/纳米注射等)也可以实现类似的效果，但前提是它们需要提供恰当的细胞刺激和快速的质粒/载体递送。
技术实现思路
1、本专利技术涉及新概念和方法的开发，该新概念和方法利用强烈的细胞刺激，可以将dna质粒和其他载体非内吞地递送至供体细胞中，从而在转染细胞内形成大量的囊泡和转录的rna以及翻译的蛋白质。细胞会分泌许多含有特定rna和具有治疗功能的蛋白质靶标的细胞外囊泡(ev)。
2、为了证明上述设计概念，制造了三维(3d)nep生物芯片，其可以用预先指定的dna质粒转染许多供体细胞，以分泌10～100倍包括外泌体在内的多个ev。这些ev含有比从未转染的供体细胞分泌的ev多数千倍的完整的高拷贝mrna和mir靶标。
3、本专利技术的一个方面为一种制备大量含有高拷贝功能性核酸和其他生物分子的治疗性细胞外囊泡(ev)的方法。这样的方法包括以下步骤：
4、将供体细胞放置在芯片的表面上，所述表面具有在其上形成的三维(3d)纳米通道电穿孔(nep)生物芯片；
5、将各种质粒、其他转染载体及其组合添加到芯片上的缓冲液中；
6、对放置在芯片表面顶部的细胞和芯片表面下方的质粒/载体缓冲溶液施加脉冲电场，使细胞受到强烈刺激并将质粒/载体以非内吞的方式递送至细胞中；和
7、收集转染细胞分泌的多个ev。
8、在一些方法中，纳米通道的直径在50-900nm之间。
9、在一些方法中，其中所述质粒和载体转录mrna、microrna、shrna和其他rna，并引起蛋白质和其他生物分子在转染细胞中的翻译。
10、在一些方法的实施例中，由转染细胞分泌的ev包含转录的mrna、microrna、shrna和其他rna、以及翻译的蛋白质和其他生物分子。
11、在一些方法的实施例中，其中将增强热休克蛋白和促进转染细胞中的囊泡形成和胞吐作用的其他蛋白的表达的方法添加到系统中，其中所述方法包括细胞的热休克处理，或在细胞培养基中添加热休克蛋白。
12、在一些实施例中，将增强促进转染细胞中外泌体形成的蛋白的表达的方法添加到系统中，其中所述方法包括cd63、cd9和其他dna质粒的共转染。
13、在一些实施例中，将多个dna质粒和其他载体连续地递送至转染细胞，以促进rna/蛋白质靶标的共定位和ev分泌。
14、在一些实施例中，将诸如dna质粒、其他转染载体、rna、蛋白质/肽、小分子药物的外源生物分子封装在细胞内的囊泡中，和通过nep连续的进行供体细胞的转染，作为治疗性ev分泌出来。在一些情况中，除了nep以外，使用其他细胞转染方法用于制备具有相似功效的治疗性ev，所述其他细胞转染方法为供体细胞提供强烈刺激，以促进ev分泌和非内吞的质粒/载体递送，用于实现快速的rna转录和蛋白质翻译。在另一些情况中，其他细胞转染方法包括基因枪、微注射或纳米注射。
15、在一些实施例中，将所述质粒和/或其他载体系留(tether)在纳米或微米大小的金或其他固体颗粒上，和使用基因枪在气动力(pneumatuc force)作用下将那些颗粒注入供体细胞中，以引起强烈的细胞刺激和非内吞的质粒/载体递送。
16、在一些实施例中，将所述质粒和/或其他载体系留在纳米或微米大小的尖端阵列上，和通过这些尖端挤压供体细胞，以引起强烈的细胞刺激和非内吞的质粒/载体递送至供体细胞中。
17、本专利技术的其他方面通过用于大量制备含有高拷贝功能性核酸和其他生物分子的治疗性细胞外囊泡(ev)的装置而实现，所述装置包括：芯片，所述芯片具有三维(3d)纳米通道电穿孔(nep)的生物芯片和在其上形成的用于接收的缓冲液，所述缓冲液适用于接收质粒和其他转染载体。
18、本专利技术的其他方面包括通过任何上述方法转染的细胞。
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1.一种大量制备含有高拷贝功能性核酸和其他生物分子的治疗性细胞外囊泡(EV)的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米通道的直径在50-900nm之间。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述质粒和载体转录mRNA、microRNA、shRNA和其他RNA，和引起蛋白质和其他生物分子在转染细胞中的翻译。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述由转染细胞分泌的多个EV包含转录的mRNA、microRNA、shRNA和其他RNA、和翻译的蛋白质和其他生物分子。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将增强热休克蛋白和其他促进转染细胞中的囊泡形成和胞吐作用的蛋白的表达的方式添加到系统中；其中所述方式包括细胞的热休克处理，或在细胞培养基中添加热休克蛋白。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将增强促进转染细胞外泌体形成的蛋白的表达的方式添加到系统中；其中所述方式包括共转染CD63、CD9和其他DNA质粒。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将多个DNA质粒
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中把诸如DNA质粒、其他转染载体、RNA、蛋白质/肽、小分子药物的外源生物分子封装在细胞内的囊泡中，和通过NEP连续转染供体细胞而作为治疗性EV分泌出来。
9.根据权利要求8所述的方法，其中除了NEP之外，用其他细胞转染方法制备具有相似功效的治疗性EV，所述其他细胞转染方法为向供体细胞提供强烈刺激以促进EV分泌和非内吞的质粒/载体递送，用于实现快速的RNA转录和蛋白质翻译。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述其他细胞转染方法包括基因枪、微注射或纳米注射。
11.根据权利要求8～10中任一项所述的方法，其中将所述质粒和/或其他载体系留在纳米或微米大小的金或其他固体颗粒上，和使用基因枪在气动力的作用下将这些颗粒注射到供体细胞中，以引起强烈的细胞刺激和非内吞的质粒/载体递送。
12.根据权利要求8～11中任一项所述的方法，其中将所述质粒和/或其他载体系留在纳米或微米大小的尖端阵列上，并通过这些尖端挤压供体细胞以引起强烈的细胞刺激和非内吞的质粒/载体递送至供体细胞。
13.一种用于大量制备含有高拷贝功能性核酸和其他生物分子的治疗性细胞外囊泡(EV)的装置，包括：
14.通过权利要求1-12中任一项所述方法转染的细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种大量制备含有高拷贝功能性核酸和其他生物分子的治疗性细胞外囊泡(ev)的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米通道的直径在50-900nm之间。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述质粒和载体转录mrna、microrna、shrna和其他rna，和引起蛋白质和其他生物分子在转染细胞中的翻译。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述由转染细胞分泌的多个ev包含转录的mrna、microrna、shrna和其他rna、和翻译的蛋白质和其他生物分子。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将增强热休克蛋白和其他促进转染细胞中的囊泡形成和胞吐作用的蛋白的表达的方式添加到系统中；其中所述方式包括细胞的热休克处理，或在细胞培养基中添加热休克蛋白。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将增强促进转染细胞外泌体形成的蛋白的表达的方式添加到系统中；其中所述方式包括共转染cd63、cd9和其他dna质粒。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将多个dna质粒和其他载体连续地递送至转染细胞，以促进rna/蛋白质靶标的共定位和ev分泌。
8.根据前述权利要求中任一项所...
【专利技术属性】
技术研发人员：L·J·李，J·施，Z·杨，
申请(专利权)人：俄亥俄州创新基金会，
类型：发明
国别省市：
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