一种培育转基因青蒿的方法、所构建的表达载体及应用技术

本发明专利技术公开了一种培育转基因青蒿的方法、所构建的表达载体及应用，将青蒿素代谢通路的5个重要酶基因及分支途径鲨烯合酶基因发夹RNA(hpSQS)利用GoldenBraid方法组装为一个T‑DNA，转化青蒿素单倍体植株，进而将阳性转化植株染色体加倍，获得了青蒿素含量高的青蒿纯合品系。本发明专利技术的转基因青蒿的青蒿素含量是非转化对照青蒿的3.43倍，本发明专利技术的方法对于以青蒿为原料提取青蒿素的药厂节约成本具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种培育转基因青蒿的方法、所构建的表达载体及应用
本专利技术属于植物转基因
，具体涉及一种培育转基因青蒿的方法、所构建的表达载体及应用。
技术介绍
青蒿素是从传统中草药黄花蒿(习惯称为青蒿)(ArtemisiaannuaL.)中分离提纯的一种具有抗疟功效的倍半萜内酯过氧化物。青蒿素的高生物利用度衍生物青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚、双氢青蒿素等已被广泛用于疟疾临床治疗，疗效确切且显著，尤其对氯喹抗性疟原虫及致命性脑型疟有效，成为疟疾治疗的一线药物。以青蒿素为基础的联合疗法(ACT)被世界卫生组织(WHO)推荐为治疗抗药性疟疾的首选疗法，其中青蒿琥酯、蒿甲醚及蒿甲醚复方被列入“基本药品目录”。青蒿素在野生青蒿植株中的含量相对很低，并且变异幅度很大。野生型青蒿中青蒿素含量范围在0.01％-1.0％(植物干重)之间，这使得青蒿素的医疗需求、商业化生产及进一步的研究都受到了很大限制。虽然人工可以合成青蒿素，但成本太高，难度大，产量也比较低，不具备实际生产条件。也有科学家尝试用合成生物学技术手段在微生物体内合成青蒿素，并且取得了很大成就：2003年，美国加州大学的Keasling小组将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS)经密码子优化后导入大肠杆菌中表达，同时用酵母萜类合成途径代替大肠杆菌萜类合成途径，首次在微生物体内合成出青蒿素的第一个关键前体—紫穗槐-4,11-二烯，在6L发酵罐中培养60h的产率达到450mg/L，2013年，Keasling领导的团队又在酿酒酵母中合成青蒿酸(青蒿酸产率达25g/L)，将微生物半合成青蒿素产业化进程向前推进了一大步。如果说青蒿素合成生物学研究具有革命性和前瞻性，在未来可能取得突破性成果，那么青蒿转基因研究则更有现实意义，因为其成果是优良的青蒿种质。目前国内外在青蒿转基因育种方面已取得诸多进展。中国科学院植物研究所叶和春教授研究小组最早开展转基因青蒿研究，他们将青蒿素合成途径上游的法呢基焦磷酸合成酶基因(FPS)导入青蒿，通过增大青蒿素合成途径的碳流，获得青蒿素含量比对照高3-4倍的转基因青蒿发根(0.2％-0.3％)及比对照高2-3倍的转基因青蒿植株(0.8-1％)。类似地，印度科学家用重组羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(HMGR)培育转基因青蒿植株，其青蒿素含量提高22.5％。Banyai等在青蒿中过表达了FPS基因，使青蒿素含量提高了1.5倍。广州中医药大学曾庆平研究员团队将反义鲨烯合酶基因(asSQS)导入青蒿，通过阻断青蒿类固醇合成分支途径对青蒿素合成分支途径所需法呢基焦磷酸(FPP)的竞争，获得类固醇含量比对照(0.08％)下降约一半(0.04％-0.05％)及青蒿素含量比对照(0.45％)提高近3倍(1.23％)的转基因青蒿植株。上海交通大学唐克轩教授研究小组利用发夹RNA介导以抑制青蒿类固醇合成，使转基因青蒿中的青蒿素含量达到3.14％，比对照提高3.14倍。这些研究结果表明采用基因工程手段，在植物中过量表达次生代谢产物生物合成途径上的基因或者干扰分支途径的表达，对于提高青蒿中青蒿素含量而言是有效的。青蒿素属于类异戊二烯化合物(isoprenoid)，也称为萜烯类化合物(terpenoid)、萜烯(terpene)。青蒿素的代谢属于植物次生代谢，青蒿素跟其他大多数萜类物质由异戊二烯基本单位构成一样，有共同的前体：异戊烯焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)。高等植物中IPP和DMAPP可以通过胞质途径的甲羟戊酸途径(MVA途径)和质体的非甲羟戊酸途径(MEP途径)合成。并且由这两个途径合成的IPP之间可以互相补充。在IPP前体的两个合成路径中有两个比较关键的酶：一个是3-基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase,HMGR)，另外一个是1-去氧木糖-5-磷酸还原酶(1-deoxyxylulose-5-phosphatereductoisomerase,DXR)，2007年Towle等通过抑制MVA或MEP途径证明了青蒿素可以通过胞质的甲羟戊酸途径或质体的非甲羟戊酸途径合成。Schramek等通过同位素标记的13CO2发现法尼基焦磷酸(FPP)由一单位MVA途径生成的异戊二烯和两单位的MEP途径合成的异戊二烯生成。法尼基焦磷酸通过后续的环化氧化等过程可以生成各种类异戊二烯终产物，如青蒿素。青蒿素特异的合成途径实际上是从紫穗槐二烯合成酶(amorhph-4,11-dienesynthase,ADS)催化FPP生成紫穗槐二烯(amorhph-4,11-diene)开始的，ADS是青蒿素合成途径的第一个关键酶，接下来紫穗槐二烯经过一个细胞色素氧化酶P450(CYP71AV1)的两次氧化生成青蒿醇(artemisinicalcohol)、青蒿醛(artemisinicaldehyde)，从青蒿醛开始到青蒿素的合成目前有两种不同的意见路径:一条通向青蒿素B再由青蒿素B转变为青蒿素,另外一条是通向二氢青蒿酸再转变青蒿素。通向青蒿素B的途径是通过CYP71AV1或一个青蒿醛脱氢酶(aldehydedehydrogenasehomologue,ALDH1)催化青蒿醛生成青蒿酸，由青蒿酸到青蒿素B的过程被认为是一个非酶参与的光催化的自发反应，Dhingra和Narasu曾认为青蒿素B可以转化为青蒿素。然而目前在青蒿中还未发现催化青蒿素B到青蒿素的酶。Brown等在2007年的研究结果倾向于证明不存在青蒿素B向青蒿素转变的这一途径，所以目前认为青蒿素B是青蒿素代谢途径中一个分支的终产物。另外一条途径是青蒿醛被一个青蒿醛双键还原酶(ArtemisinicAldehyde△-11(13)Reductase,DBR2)转变为二氢青蒿醛，二氢青蒿醛又经过青蒿醛脱氢酶(ALDH1)的催化转变为二氢青蒿酸(DihydroartemisinicAcid,DHAA)，目前认为二氢青蒿酸是青蒿素的直接前体，由它向青蒿素的转变是一个非酶参与的光催化的自发反应。Wallaart等发现二氢青蒿酸在青蒿素含量高植株中大量积累，并且其含量和青蒿素含量成正比。因此这暗示着在植物体内二氢青蒿酸向青蒿素的转变是一个限速步骤，虽然目前很多证据证明这是一个自发反应，但从理论上讲我们可以找到或创造一个催化此步骤的酶。Ryden等在2010年克隆到一个二氢青蒿醛还原酶(Red1)，发现这个酶同ALDH1竞争共同底物二氢青蒿醛，它将二氢青蒿醛转变为二氢青蒿醇，因此这个酶的作用会减少青蒿素的合成。多基因的组装往往受载体多克隆位点的限制。目前，有多种载体系统可以提供多基因的组装。如pBECKS2000系列提供一种多基因连接策略，但这个系统仍需要通过常规的酶切除去中间载体骨架，组装只能进行2-3次循环。Goderis等发展了一套最多可以插入6个基因的多基因组装载体系统，转化载体pPZP-RCS的多克隆位点含有13个六碱基限制位点，6个八碱基限制位点和5个homingendonuclease位点。6个中间载体pAUX系列的多克隆位点两侧分别置有上述稀有酶切位点相对应的其中一个。通过酶切连接可以依次将6个中间载体上的表达卡盒转移本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培育转基因青蒿的方法，其特征在于包括：将青蒿素合成通路特异基因ADS、AMO、CPR、ADH1和ALDH1五个基因及针对鲨烯合酶基因的内含子发夹RNA通过GoldenBraid方法组装为一个T‑DNA单元；利用所述T‑DNA单元转化青蒿素单倍体植株，然后将阳性转化植株染色体加倍，得到转基因青蒿。

【技术特征摘要】
1.一种培育转基因青蒿的方法，其特征在于包括：将青蒿素合成通路特异基因ADS、AMO、CPR、ADH1和ALDH1五个基因及针对鲨烯合酶基因的内含子发夹RNA通过GoldenBraid方法组装为一个T-DNA单元；利用所述T-DNA单元转化青蒿素单倍体植株，然后将阳性转化植株染色体加倍，得到转基因青蒿。2.根据权利要求1所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：将青蒿素合成通路特异基因分别组装为过表达转录单位，将针对鲨烯合酶基因的内含子发夹RNA模块组装为转录单位，然后再利用限制性酶切-连接的方法将上述多个转录单位组装为一个T-DNA单元。3.根据权利要求2所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：所述过表达转录单位由启动子-关键酶基因的编码序列-终止子三类元件组成。4.根据权利要求2或3所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：发夹RNA模块组装的转录单位由NOS启动子-SQS基因片段-内含子-SQS基因倒置片段-NOS终止子组成。5.根据权利要求4所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：所述的SQS基因片段核苷酸序列如SEQIDNo.18所示。6.根据权利要求1、2、3或5所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：将各个基因扩增并限制酶切-连接到pUPD2的BsmBI位点，得到载体：pADS、pAMO、pCPR、pADH1、pALDH1、pSQSGOI及pSQSIOG。7.根据权利要求6所述的培育转基因青蒿的方法，其特征在于：将pADS、pP35S、pTnos通过BtgZI/BsmBI酶切-连接到pDGB1Ω1载体，构建为转录单位TU_P35S:ADS:T35S_Ω1(命名为TU1)，用同样的方法将其余基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘炜松，吴川，肖丽丽，唐星宇，龚樱，龙孝云，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43