一种耐冷红掌的转基因培育方法技术

本发明专利技术涉及一种耐冷红掌的转基因培育方法，包括以下步骤：取主栽红掌品种的顶芽为外植体，诱导愈伤组织，继代培养至快速增殖期，暗条件预培养，进行农杆菌共培养，转移到筛选培养基进行４轮筛选，取抗性愈伤组织诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，鉴定含目的基因的分化小苗，转移至生根培养基长成正常幼苗，对入选的转基因植株进行耐冷性鉴定，选留不受冻冻危害的转基因植株，继续种植入选的转基因红掌株系，评价验证耐冷性的表达稳定性，对稳定的优良株系进行繁殖，培育抗低温冻害的转基因耐冷红掌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
红掌系天南星科花烛属多年生草本植物，在许多热带国家和地区被列为主 要切花品种，是仅次于热带兰的第二大宗热带花卉商品。红掌既是最受欢迎的io种切花之一，又是最受欢迎的IO种盆栽植物之一，其销售额仅次于蝴蝶兰，是所有切花品种中增长最快的。我国的红掌产业经历20多年的发展，在生产规模和研发力量等方面取得了 较大进步，但总体的研发与销售与国际水平相距甚远。尽管很多地方均有生产， 却仍无具有自主知识产权的红掌新品种，其种苗主要来自国外。与此同时，由 于我国冬季低温的原因导致红掌在我国红掌难以自然环境种植，必须人工温室 条件下加温控制种植，不仅大幅度提高生产成本，而且低温冻害也显著降低了 红掌的观赏和商用品质。CBF基因是几年前发现的一类耐逆相关基因，其所编码的转录激活因子能 与CRT/DRE的DNA调控元件特异结合，促进启动子中含有这一调控元件的多 个冷诱导基因的表达，从而引起植株耐冷性的增强。正是在该背景下，本专利技术 提出一种耐冷红掌的培育方法，旨在培育出耐冷红掌新品种，显著降低红掌的 生产成本，提高观赏和商用品质，对提高我国红掌产业的竞争力和经济效益具 有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，以获得更适合冬 季低温种植的红掌新品种。耐冷红掌的转基因培育方法，包括以下步骤1) 取主栽红掌品种的顶芽为外植体，接种至诱导培养基，诱导愈伤组织；2) 取诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织 进入快速增殖期；3) 取快速增殖的愈伤组织，在25"C黑暗条件下进行受体愈伤组织预培养3天；4) 取预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液， 用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在23"C黑暗条件下共培养3天；5) 取共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25'C黑暗条 件下培养4周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进 行连续3轮继代筛选，每隔4周转继1次；6) 取4轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，诱导分化成苗，对 抗性植株进行葡糖苷酸酶基因组织化学染色和潮霉素基因分子检测，选取含目 的基因的分化小苗，转移至生根培养基长成幼苗；7) 取入选的转基因植株，转移至温度0'C下进行耐冷性鉴定4周，选留不 受冻冻危害的转基因植株；8) 继续种植步骤7)筛选的转基因红掌株系，室内外评价验证耐冷的表达 稳定性，对稳定的优良株系进行繁殖，培育出转基因耐冷红掌。上述的稳定性是指入选红掌的耐冷性可在不同年份间(2年及以上)、季节 间(2季及以上)以及地点间(2个地点及以上)表达一致，特性不受年份、季 节以及地点的显著影响。本专利技术中，所说的诱导培养基为1/2MS基本培养基添加2，4-D 0.6mg、 6-BA 0.5mg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。本专利技术中，所说的继代培养基为MS基本培养基添加2，4-D 0.6mg、 6-BA 2mg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。本专利技术中，所说的共培养基为1/2MS基本培养基添加ABA 5mg/L、 2,4-D 0.6mg、 6-BA2mg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。本专利技术中，所说的共培养基为1/2MS基本培养基添加潮霉素100mg、 ABA 5mg/L、 2,4-D0.6mg、 6-BA2mg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。本专利技术中，所说的分化培养基为MS基本培养基添加KT lmg、 NAA 0.2mg、 蔗糖30g、琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。本专利技术中，所说的生根培养基为MS基本培养基添加NAA0.5mg、蔗糖30g、 琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。上述的MS基本培养基为大量元素(NH4N03 650mg、 KN03 900mg、 CaCl2.2H20 440mg、 MgS04.7H20 370mg、 KH2PO4700mg)、微量元素(KI0.83 mg、 H3B036.2mg、 MnS04.4H20 22.3mg、 ZnS04.7H20 8.6mg、 Na2Mn04.2H20 0.25mg、 CuS04.5H20 0.025mg、 CoCl2.6H20 0.025mg 、 FeS04.7H20 27.8mg Na2-EDTA'2H20 37.3mg)和有机成分(肌醇100mg、烟酸0.5mg、维生素B6 0.5mg、维生素B10.5mg、甘氨酸2mg)。本专利技术中，所说的农杆菌的菌株为超毒力型EHA105， 含质粒pCMD。pCMD的T-DNA区携带有拟南芥耐逆相关CBF1基因、潮霉素磷酸转移酶基因 和葡糖苷酸酶基因。CBFl基因长642bp，与CaMV35S启动子和胭脂碱合成酶 终止子共同构成表达框架。菌株EHA105可方便购买或赠送获得，在一般植物 基因工程实验室均有保存，参见文献吴关庭等，中国农业科学，2005， 38(12): 2395-240。本专利技术中，所说的葡糖苷酸酶基因组织化学染色方法参见Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletter, 1989， (6): 168-169，潮霉素基因分子检测方法参见吴 关庭等，中国农业科学，2005， 38(12): 2395-240。本专利技术具有以下几方面的有益效果培育的转基因耐冷红掌新品种，比普通红掌品种能抗低温冻害能力，显著 降低红掌的生产成本，提高观赏和商用品质，有利于提升品质、节约成本推动 红掌的产业化发展。 具体实施例方式以下通过具体实例进一步说明本专利技术。实施例1:以红掌品种"火焰"的顶芽为外植体，接种至诱导培养基，诱导愈伤组织； 取诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入快 速增殖期；取快速增殖的愈伤组织，在25i:黑暗条件下进行受体愈伤组织预培 养3天；取预培养的愈伤组织(约2000个培养皿，含20000块以上的愈伤组织)， 在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培 养基上，在23t:黑暗条件下共培养3天；取共培养愈伤组织，洗净、晾干后， 转移到筛选培养基，在25t黑暗条件下培养4周，收集长出的抗性愈伤组织(约 300块)，转移至新的筛选培养基上，再进行连续3轮继代筛选，每隔4周转继 l次；取4轮筛选后的抗性愈伤组织(39块)，转移至分化培养基，诱导分化 成苗35株，对抗性植株进行葡糖苷酸酶基因组织化学染色和潮霉素基因分子检 测，选取含目的基因的分化小苗16株，转移至生根培养基长成正常幼苗12株； 取入选的转基因植株，转移至温度(TC下进行耐冷性鉴定4周，选留不受冻冻危 害的转基因植株3株；继续种植入选的转基因红掌株系，在2007-2008年室内外 评价模拟评价耐冷的表达稳定性，获得抗低温冻害的转基因耐冷红掌株系1个， 即TCT-Aa-l，可经受(TC低温冷害。权利要求1.，其特征在于包括以下步骤1)取主栽红掌品种的顶芽为外植体，接种至诱导培养基，诱导愈伤组织；2)取诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入快速增殖期；3)取快速增殖的愈伤组织，在25℃黑暗条件下进行受体愈伤组织预培养3天；4)取预培养的愈伤组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐冷红掌的转基因培育方法，其特征在于包括以下步骤：　１）取主栽红掌品种的顶芽为外植体，接种至诱导培养基，诱导愈伤组织；　２）取诱导形成２周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入快速增殖期；　３）取快速增殖的愈伤组织， 在２５℃黑暗条件下进行受体愈伤组织预培养３天；　４）取预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡１５分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在２３℃黑暗条件下共培养３天；　５）取共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基， 在２５℃黑暗条件下培养４周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续３轮继代筛选，每隔４周转继１次；　６）取４轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，诱导分化成苗，对抗性植株进行葡糖苷酸酶基因组织化学染色和分子检测， 选取含目的基因的分化小苗，转移至生根培养基长成幼苗；　７）取入选的转基因植株，转移至温度０℃下进行耐冷性鉴定４周，选留不受冻冻危害的转基因植株；　８）继续种植步骤７）筛选的转基因红掌株系，室内外评价验证耐冷的表达稳定性，对稳定的优良株系 进行繁殖，培育出转基因耐冷红掌。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田丹青，舒小丽，葛亚英，叶红霞，周志丹，吴殿星，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[]