一种利用山菠菜BADH基因转化培育耐盐番茄的方法技术

一种用转甜菜碱醛脱氢酶基因（ＢＡＤＨ）培育耐盐番茄株系的方法，该方法包括如下步骤：ａ，将含有ＢＡＤＨｃＤＮＡ的基因片断的双元表达载体ｐＢｉｎ４３８的农杆菌ＬＢＡ４４０４感染番茄真叶叶片；ｂ，感染后的番茄叶片置于ＩＭ培养基上进行分化培养；ｃ，取分化植株幼嫩叶片提取基因组ＤＮＡ进行分子检测；ｄ，转基因植株的ＢＡＤＨ活性检测和耐盐性鉴定。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物生物
通过基因工程抗盐基因转化手段提高植物的耐盐性。2.技术背景植物生长在自然环境中，经常受到不良环境条件的影响。其中，盐害是限制植物的地理分布并在一定程度上影响其产量和质量的一个重要因素(Boyer，1982)。在长期的进化过程中，植物形成了适应和抵御盐胁迫的机制。常见的一种就是合成小分子有机物如氨基酸衍生物(脯氨酸、甜菜碱等)、糖类、醇类等。甜菜碱通过平衡细胞与周围环境的渗透压、稳定蛋白质的四级结构和保护细胞内的酶系统来保护植物细胞，以减少盐胁迫下植物所受的伤害(Bernard等，1988；Papageorgiou等，1995)。植物细胞中，甜菜碱是在叶绿体内通过两步反应合成。第一步是由胆碱单氧化酶(CMO)催化胆碱形成甜菜碱醛；第二步是在甜菜碱醛脱氢酶(BADH)的作用下由甜菜碱醛氧化生成甜菜碱。编码合成BADH酶的基因已在多种植物中被成功克隆，如菠菜(Weretilnyk等，1990)、山菠菜(肖岗等，1995)、甜菜(McCue等，1992)、高粱(Wood等，1996)等。研究结果表明，许多植物如拟南芥、烟草和番茄属盐敏感植物但自身不能合成和积累甜菜碱(Weretilnyk等，1989；Rhodes等，1993；Nuccio等，1998)。这就引起了人们对导入甜菜碱合成途径合成甜菜碱以提高盐敏感植物耐盐性的兴趣。番茄是世界上分布广泛的一种蔬菜作物，但其栽培品种对盐比较敏感。土壤和灌溉水的盐碱化在很大程度上降低了番茄的产量，造成很大的经济损失(Foolad，1999；Cuartero等，1999)。在可利用耕地面积日益减少，土质日趋恶化的今天，提高栽培番茄的耐盐性，增强番茄对不良土壤环境的适应能力，不但可以充分利用有限的土地资源，而且具有很大的经济和社会效益。3.
技术实现思路
番茄是在全世界广为栽培的常规蔬菜种类，栽培番茄品种普遍对盐敏感。本专利技术通过农杆菌介导的方法，将山菠菜BADH基因导入栽培番茄，提高了栽培番茄品种的耐盐性。实现本专利技术的具体技术步骤如下a，将含有BADH cDNA的基因片断的双元表达载体pBin438的农杆菌LBA4404感染番茄真叶叶片；b，感染后的番茄叶片置于IM培养基上进行分化培养；c，取分化植株幼嫩叶片提取基因组DNA进行分子检测；d，转基因植株的BADH活性检测和耐盐性鉴定。通过导入甜菜碱合成途径提高植物的耐盐性已有一些报道(Rathinasabapathi等，1994；刘凤华等，1995；郭岩等，1997；Trossat等，1997；李银心等，2000)，但以蔬菜作为研究对象的很少。番茄是一种经济价值较高、市场潜力较大的蔬菜，栽培番茄品种普遍对盐敏感；研究表明，番茄植物中缺乏内源BADH合成途径(McCue和Hanson，1990；Weretilnyk等，1989)，因此，通过将BADH基因导入番茄，建立番茄甜菜碱合成途径，可以提高栽培番茄品种的耐盐性。尽管植物的耐盐性是一个由多基因控制的复杂数量性状，通过基因工程提高植物的耐盐性仍然存在挑战。本技术专利技术通过农杆菌介导的山菠菜BADH基因转化番茄栽培品种“百利春”，证明通过该技术手段可以提高番茄的耐盐性。4.附图说明图1、双元表达载体结构简图。双元表达载体pBin438含有双35S启动子和TMV的Ω片段翻译增强子，山菠菜BADH cDNA片段插入pBin438的BamHI和KpnI位点。图2A-C、转基因番茄分化。A.未感染叶片在卡那筛选培养基上死亡；B.转基因愈伤组织；C.转基因植株图3A-C、转基因番茄分子检测。A.PCR检测；B.Southern检测；C.Northern检测图4、转基因番茄中的BADH活性图5、转基因番茄在盐胁迫下叶片电导率的变化图6、T1植株PCR检测A.T1-1；B.T1-8图7、T1植株Northern检测1，2T1-1 PCR阳性植株；3T1-1 PCR阴性植株；4T1-8 PCR阴性植株；5，6T1-8 PCR阳性植株图8、盐胁迫对转BADH基因T1代种子发芽率的影响图9、转BADH基因T1植株电导率变化5.实施例1〕材料“百利春”番茄(Lycopersicon esculentum Mill)种子由中国农科院购得。种子分别用70％酒精和0.1％升汞进行表面消毒1分钟和15分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗三次。播种于不加任何激素的MS基本培养基中(Murashige等，1962)。培养室温度保持在25±2℃，湿度70％-80％，每天光照12小时。PCR反应所用Taq酶和引物由上海生工公司购买和合成。限制性内切酶和Random Primer Labeling System Kit由Takara公司购买。Trizol由GIBCO公司购买。植物表达载体由中国科学院遗传研究所陈受宜研究员提供。双元表达载体pBin438含有双35S启动子和TMV的Ω片段翻译增强子，BADH cDNA片段插入pBin438的BamHI和KpnI位点(图1、)。2〕农杆菌转化和转基因番茄的筛选用液体YEB+卡那霉素50mg/L培养基将含表达载体的LBA4404农杆菌培养至OD560＝0.5后，用无激素的MS液体培养基稀释10倍。将番茄无菌真叶叶片于其中感染5分钟。随后取出叶片，用无菌滤纸吸干表面菌液，置于IM培养基(MS+IAA0.2mg/L+BA2.0mg/L+ZT0.1mg/L)上黑暗中共培养48小时。之后转移至IM+卡那霉素50mg/L+羧苄青霉素500mg/L培养基上进行分化培养，每天光照12小时。观察结果显示，未经农杆菌感染的叶片在筛选培养基上2周后变黄或变白，叶片死亡，伤口处无愈伤长出。经农杆菌感染的番茄叶片，2-3周后开始叶缘出现绿色芽点，5-6周后分化出小植株。当这些小植株长到2-3cm高时，将其转移至MS+卡那霉素500mg/L+羧苄青霉素500mg/L培养基上生根。这些小植株能顺利生根并且生长基本正常(图2、)。3〕转基因植株的命名当代转基因株系为TG0加上各自的株系号，如TG0-1，TG0-2。各株系严格自交的后代为TG1加上各自的株系号，如TG1-1，TG1-2等。4〕转基因植株的分子检测取0.1-0.2g分化植株的幼嫩叶片用CTAB法提取基因组DNA。PCR反应体系按标准方法。所用引物为5’-AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC-3’和5’TTCAAGGAGACTTGT ACCATCCCCA-3’，反应程序为95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共35个循环(肖岗等，1995)。将基因组DNA(20μg)分别用HindIII和EcoRI酶切，在1.0％琼脂糖凝胶50V电泳5小时，并将DNA转移至Hybond-N+尼龙膜上(Sambrook等，1989)。探针以BADH cDNA为模板，用α-32P-dCTP，Randon PrimerLabeling System(Takara)试剂盒标记。RNA提取用Trizol一步法，用1.2％甲醛变性胶电泳，转膜、杂交方法及所用探针同Southern杂交。PCR和Southern杂交检测结果表明BADH基因已整合到6个株系的基因组中(图3A，B)，但从Southern结果可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用转甜菜碱醛脱氢酶基因（ＢＡＤＨ）培育耐盐番茄株系的方法，该方法包括如下步骤： ａ，将含有ＢＡＤＨ ｃＤＮＡ的基因片断的双元表达载体ｐＢｉｎ４３８的农杆菌ＬＢＡ４４０４感染番茄真叶叶片； ｂ，感染后的番茄叶片置于ＩＭ培养基上进行分化培养； ｃ，取分化植株幼嫩叶片提取基因组ＤＮＡ进行分子检测； ｄ，转基因植株的ＢＡＤＨ活性检测和耐盐性鉴定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李银心，朱至清，贾庚祥，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]