一种培育高抗病毒转基因植物的方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种培育高抗病毒转基因植物的方法与应用，本发明专利技术的方法包括以下步骤：ａ．查阅宿主密码子的使用频率，确定稀有密码子，修饰目的基因中的密码子，把目的基因中某些密码子突变成宿主植物中的稀有同义密码子；ｂ．构建含有密码子修饰目的基因的用于植物转化的载体；ｃ．转化植物，获得再生转基因植株；ｄ．检测转化植株，筛选目的基因发生基因沉默的转基因植株，获得高抗病毒转基因植株。利用本发明专利技术的方法可以培育高效稳定的抗病毒转基因植物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及培育转基因植物的方法与应用，具体说是一种培育高抗病毒转基因植物的方法与应用。
技术介绍
植物病毒是农作物生产上的主要病害之一，植物病毒有时会对农业生产造成灾难性的影响，培育高抗病毒的转基因植物是生物学研究的热点。近年来研究发现，基因沉默机制是植物抵御病毒入侵的一种防御机制(Covey，SN，1997，Nature，385(27)781-782)，基因沉默现象最早是1990年Napoli等(NapoliC，et al.1990，Plant Cell，2279-289；Van der Krol Ar，et al.1990，PlantCell，2291-299)在研究转查尔酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)基因chs的矮牵牛植株中发现的。由于不但外源的chs基因不能表达，内源的chs基因的表达也被沉默了，称之为共抑制(co-suppression)。不但转化的基因可以发生基因沉默现象，宿主的内源基因也可以被转基因或病毒诱导而沉默(Ruiz MT，et al.，1998，PlantCell，10(6)937-946；Dalmay T，et al.，2000，Plant Cell，12(3)369-379)。这种基因沉默现象普遍存在于植物、动物、细菌及真菌中(Land，KM.2001，Trends inGenetics，17(7)379)。研究发现转病毒来源基因的植物也可以发生“恢复”现象，被病毒感染后的转基因植物的新生叶片具有针对这种病毒的抗性，植物内的转基因也同时发生沉默现象(Covey，SN，et al.1997，Nature，385(27)781-782)。此外当携带有植物基因的病毒侵染植物时，植物内源的相应基因也可以被沉默(Jones L，et al.1999，PlantCell，11(12)2291-301；Burton RA，et al.2000，Plant Cell，12(5)691-706)。含有非病毒或非植物来源的转基因植物，用携带有此基因的病毒侵染后，这种基因也同样可以发生沉默。因此，病毒既是基因沉默的对象，又是基因发生沉默的诱导因子(Ratcliff，FG.et al.1999，The Plant Cell，11，1207-1215)。当植物受到病毒侵染后会启动基因沉默机制，使病毒不能在其体内进行繁殖，植株表现出免疫或高抗；转录后基因沉默是植物抵御病毒入侵的一种免疫机制(Voinnet，O.2001，Trendsin Genet，17449-459；Matzke，MA.et al，2002，Adv Genet，46235-75；PlasterkRH.Science，2002，17；296(5571)1263-5；Baulcombe DC，Trends Microbiol，2002，10(7)306-8)。基因沉默机理的研究，使得根据基因沉默机理培育出抗病毒的转基因植物成为可能。对基因沉默应用一个关键的问题就是如何提高目的基因发生沉默的机率。虽然利用病毒载体可以简便有效地诱导基因失活，但病毒载体的限制决定了对某些特定宿主中的特有基因无法进行研究利用；另外，虽然利用转化方法可以产生基因沉默，但是自然条件下产生基因沉默的效率较低。因此，如果能提供一种可以有效提高目的基因在转基因宿主中失活的方法，由此方法就可以培育高抗病毒的转基因植物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以有效提高目的基因在转基因宿主中失活，由此培育高抗病毒转基因植物的方法。一种培育高抗病毒转基因植物的方法，包括以下步骤a.查阅宿主密码子的使用频率，确定稀有密码子，修饰目的基因中的密码子，把目的基因中某些密码子突变成宿主植物中的稀有同义密码子；b.构建含有密码子修饰目的基因的用于植物转化的载体；c.转化植物，获得再生转基因植株；d.检测转化植株，筛选目的基因发生基因沉默的转基因植株，获得高抗病毒转基因植株。为了便于筛选，所述载体中还含有选择标记基因。所述稀有密码子为使用频率在0-10‰之间的密码子。所述载体可以为原核表达载体，也可以为真核表达载体。一般情况下是在GenBank等基因库中查阅宿主密码子的使用频率，所述的目的基因是指具有研究意义和应用价值的基因。所述突变方法包括一切以突变目的基因中密码子为稀有同义密码子为目的的常规突变方法，如定点突变等。用于转化宿主的方法包括一切可以将外源基因导入宿主内的常规方法，如农杆菌介导，基因枪法等。用本专利技术的方法得到的细胞系及植株均属于本专利技术的保护范围。本专利技术的方法在植物育种，特别是培育高抗病毒转基因植物中具有重要的理论及实际意义。本专利技术的依据是每种生物体内都有许多的tRNA池(pool)，即有一定的tRNA丰度。如果某种tRNA缺乏或被大量使用，相应的tRNA池就会变小(Ikemura T.1985，Mol.Biol.Evol.，213-35；Antezana MA，1999，J Mol Evol，49(1)36-43)，一般来说稀有tRNA的池比丰富tRNA的池更容易被变小。当在细菌中表达不同的花生过敏原时发现，cDNA中含AGA/AGG密码子达8-10％的Arah 1、2、6比含AGA/AGG密码子达0.8％的Ara h 5表达量要低很多。在不改变密码子含量的情况下，在细菌中表达大肠杆菌的编码精氨酸稀少tRNA的argU、ileY和lueW基因，使精氨酸稀少密码子含量高的Arah1、2、6表达提高了100多倍(Kleber-Janke T，et al.2000，Protein Expr Purif，19419-424)。如果把GA重复片断插入lacZ编码框(ORF)中，特意产生移码突变，产生了许多稀有密码子，研究发现由于稀有密码子的增多，相应的tRNA被大量使用，导致翻译在核糖体A位点空缺的机率增大，表达水平下降(Bregeon D，et al.2001，GenesDev，152295-306)。Chen等发现在LacZ起始密码子的后面插入4个连续的大肠杆菌很少使用的精氨酸Arg的密码子，结果造成LacZ翻译效率的下降，并且增加稀有密码子与起始密码子之间的距离，翻译效率会有所增加。对此解释是在翻译起始的早期，由于tRNA的缺乏，造成核糖体停顿时间过长，发生“移动堵塞”(traffic jam)，增加了核糖体的不稳定性，容易引起mRNA的降解(Chen，GFT.，et al.1990，Nucl AcidsRes.181465-1473)。利用同义的稀少密码子替换酵母中磷酸甘油酸激酶(PGK1)中正常的密码子，发现蛋白表达量减少了10倍以上(Hoekema A.，et al.1987，Mol.Cell.Biol.72914-2924)。同样利用本方法构建的表达载体中的目的基因含有大量的稀有密码子，在导入宿主体内表达时，相应mRNA更易于被降解(Rocher EJE.et al.1998，Plant physiol.1171445-1461)，目的基因的表达就会降低或甚至被完全关闭。本专利技术对马铃薯X病毒外壳蛋白(coat protein，cp)基因中的某些密码子进行了同义稀有密码子的替换，使其含有较多的稀有密码子。构建转化载体后转化烟草，分子检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培育高抗病毒转基因植物的方法，包括以下步骤：　　　　ａ．查阅宿主密码子的使用频率，确定稀有密码子，修饰目的基因中的密码子，把目的基因中某些密码子突变成宿主植物中的稀有同义密码子；　　　　ｂ．构建含有密码子修饰目的基因的用于植物转化的载体；　　　　ｃ．转化植物，获得再生转基因植株；　　　　ｄ．检测转化植株，筛选目的基因发生基因沉默的转基因植株，获得高抗病毒转基因植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱祯，冯德江，郑翔，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]