唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法。所述唾液腺组织特异性的转基因载体是通过将小鼠腮腺蛋白启动子上游调控区序列和可视化筛选neo-EGFP融合双标记整合到piggyBac转座系统和Lox-Cre酶系统中构建得到，该转基因载体可使目的蛋白在特定组织表达，实现大片段的高效整合效率；且该载体还具有便于筛选的绿色荧光标记和真核细胞筛选的新霉素抗性基因，使转基因细胞筛选和转基因动物鉴定更简单、直接、准确；本发明专利技术的转基因载体是一种唾液腺特异表达高效整合通用载体，可用于转基因小鼠和猪等动物方面转基因应用。本发明专利技术首次克隆FVB小鼠上游调控区，克隆方法简单高效，有效克服了大片段载体构建难度。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种。所述唾液腺组织特异性的转基因载体是通过将小鼠腮腺蛋白启动子上游调控区序列和可视化筛选neo-EGFP融合双标记整合到piggyBac转座系统和Lox-Cre酶系统中构建得到，该转基因载体可使目的蛋白在特定组织表达，实现大片段的高效整合效率；且该载体还具有便于筛选的绿色荧光标记和真核细胞筛选的新霉素抗性基因，使转基因细胞筛选和转基因动物鉴定更简单、直接、准确；本专利技术的转基因载体是一种唾液腺特异表达高效整合通用载体，可用于转基因小鼠和猪等动物方面转基因应用。本专利技术首次克隆FVB小鼠上游调控区，克隆方法简单高效，有效克服了大片段载体构建难度。【专利说明】
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种唾液腺组织特异性的高效整合转基因载体及其构建方法，本专利技术还涉及小鼠腮腺蛋白上游调控区的PCR扩增片段及其克隆方法。
技术介绍
传统载体构建主要借助基因工程限制性内切酶、T4连接酶以及PCR技术把目的片段连接到相应的载体骨架上，然后经过酶切鉴定，测序验证，完成载体构建。根据实验需要有时需要连接多个片段，常因限制性酶切位点限制，使实验设计越来越困难，载体片段越来越大而导致T4连接酶效率低下，载体构建难度大。因此，传统载体构建技术在大载体(12Kb以上)载体构建方面很难成功。腮腺蛋白是腮腺中表达丰度最高的蛋白。腮腺蛋白基因定位在小鼠2号染色体上，在基因组中该基因以单拷贝形式存在，且主要在腮腺特异表达，还有研究显示其在唾液腺的颌下腺和舌下腺也有低表达。研究显示该基因主要是由腮腺蛋白基因的上游调控区(11.5Kb)和下游序列(约2.5~3kb)(即腮腺蛋白启动子PSP)调控的，但其调控基因仅在唾液腺中调控表达，在全身其他组织器官不表达。唾液腺表达外源蛋白的转基因动物原理就是借助腮腺蛋白启动子可以把目的蛋白(酶或者药物)在腮腺、舍下腺以及下颌下腺等唾液腺体经表达后直接分泌到动物唾液中，经口腔进入动物消化道，来发挥其功能。小鼠腮腺启动子(PSP)载体应用方面最近的报道还是2001年，由加拿大的学者Serguei P.Golovan在制备环境友好动物时应用的,该载体结构比较简单,仅用植酸酶基因代替原来腮腺蛋白基因，没有筛选标记和荧光标记，整合效率也比较低，且整合进基因组多已头尾串联形式，这种整合模式在基因组内，更容易被沉默和丢失，因为没有筛选标记，该载体只适合原核注射或者ICS`I (胞浆注射)方法生产转基因动物，动物中经济价值较大是猪，但猪受精卵不透明，看不到原核。且猪早期胚胎收集难度大，技术难题大。其载体结构如图1所示。2006年由中国农业大学伊海芳构建2个猪腮腺蛋白启动子(PSP)载体，除了载体骨架，这两个载体都采用猪PSP部分上游调控区序列(IOkb)连接植酸酶基因，其差异在其后面加尾信号:一个是bGH-pA ;另一个是猪腮腺蛋白PSP下游的Poly-PA。这两个载体都带一个药物筛选基因neo。虽然这两个载体可以进行药物筛选，但没有可视标记，对筛选转基因细胞很难确认，仍是传统载体，其整合模式与Serguei P.Golovan构建小鼠腿腺蛋白载体类似。但猪腮腺蛋白启动子由于其研究还不够透彻，目前分析，在其上游IOKb调控区内，调控元件不全，可能在其它区域还存在其它增强子区，导致其下游蛋白酶基因表达量低。2个猪腮腺蛋白启动子(PSP)载体结构如图2所示。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种。为实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案:一种唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，包括以下步骤:(I)、分别以质粒 pcDNA3.1 (+)和 pT2AL200R175_CAGGS_EGFP 为模板，SEQ ID NO: 5和SEQ ID N0:6、及SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8为引物进行第一次PCR扩增，获得带有若干重叠序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5-3 μ L混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo-EGFP融合基因；用EcoR I和Xba I双酶切pcDNA3.1 (+)和neo-EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP载体；(2)、以质粒 pPB-UbC-EGFP-neo 为模板，分别以 SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 10、及 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 作为引物，进行 PCR 扩增得到 Not 1-5-PB-Not I，Xho 1-3-PB-Xho I，分别采用Not I和Xho I酶切后，连接在载体pPSPBGPneo-XynB上，得到载体 pPSPBGPneo-PB-XynB ；(3)、以步骤(1)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP载体为模板，用长片段PCR体系，SEQID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 作为引物进行 PCR扩增得到 infusion-CMV-neo-T2A_EGFP 片段，切胶纯化；用Cla I和Bgl II双酶切步骤⑵得到的载体pPSPBGPneo-PB-XynB，对目的片段切胶纯化；将infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重组到pPSPBGPNeo-PB-XynB载体的两个1xp 位点中间，得到 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 载体；(4)、以步骤(3)得到的 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 载体为模板，SEQ IDNO: 15和SEQ ID NO: 16作为引物，进行PCR扩增，得到载体中的pPB-lox—neoEGFP—loxp片段，并添加AgeI限制性内切酶位点，纯化，得到新载体骨架；(5)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，SEQ ID N0:17和SEQID勵:18为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游400%?片段，将400%?片段与新载体骨架pPB-lox-neoEGFP-`loxp中的重组序列进行重组，得到中间载体I ;(6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID N0:19和SEQ ID N0:20为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4706bp片段；将其重组到步骤(5)的中间载体I的StuI位点，即为中间载体2 ；(7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID N0:21和SEQ ID NO: 22为引物，利用AgeI位点，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游3956bp片段；将其重组到步骤出)的中间载体2上，得到载体pPB-MusPSP-neo-EGFP，即为唾液腺组织特异性的转基因载体。在其中一个实施例中，所述步骤(5)-(7)中的小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段的克隆方法为:以FVB小鼠基因组DNA为模板，SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2为引物，KOD-FX聚合酶进行第一次PCR扩增；以第一次扩增的产物为模板，SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4为引物，进行第二次PCR扩增，即得。在其中一个实施例中，所述步骤(5)-(7)中第本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、分别以质粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175?CAGGS?EGFP为模板，SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6、及SEQ?ID?NO:7和SEQ?ID?NO:8为引物进行第一次PCR扩增，获得带有若干重叠序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5?3μL混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo?EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pcDNA3.1(+)和neo?EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA?Neo?T2A?EGFP载体；(2)、以质粒pPB?UbC?EGFP?neo为模板，分别以SEQ?ID?NO:9和SEQ?ID?NO:10、及SEQ?ID?NO:11和SEQ?ID?NO:12作为引物，进行PCR扩增得到NotⅠ?5?PB?NotⅠ，XhoⅠ?3?PB?XhoⅠ，分别采用NotⅠ和XhoⅠ酶切后，连接在载体pPSPBGPneo?XynB上，得到载体pPSPBGPneo?PB?XynB；(3)、以步骤(1)得到的pcDNA?neo?T2A?EGFP载体为模板，用长片段PCR体系，SEQ?ID?NO:13和SEQ?ID?NO:14作为引物进行PCR扩增得到infusion?CMV?neo?T2A?EGFP片段，切胶纯化；用ClaⅠ和BglⅡ双酶切步骤(2)得到的载体pPSPBGPneo?PB?XynB，对目的片段切胶纯化；将infusion?CMV?neo?T2A?EGFP片段重组到pPSPBGPNeo?PB?XynB载体的两个loxp位点中间，得到pPSPBGPneo?T2A?EGFP?PB?XynB载体；(4)、以步骤(3)得到的pPSPBGPneo?T2A?EGFP?PB?XynB载体为模板，SEQ?ID?NO:15和SEQ?ID?NO:16作为引物，进行PCR扩增，得到载体中的pPB?lox?neoEGFP?loxp片段，并添加AgeI限制性内切酶位点，纯化，得到新载体骨架；(5)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，SEQ?ID?NO:17和SEQ?ID?NO:18为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4009bp片段，将4009bp片段与新载体骨架pPB?lox?neoEGFP?loxp中的重组序列进行重组，得到中间载体1；(6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ?ID?NO:19和SEQ?ID?NO:20为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4706bp片段；将其重组到步骤(5)的中间载体1的StuI位点，即为中间载体2；(7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ?ID?NO:21和SEQ?ID?NO:22为引物，利用AgeI位点，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游3956bp片段；将其重组到步骤(6)的中间载体2上，得到载体pPB?MusPSP?neo?EGFP，即为唾液腺组织特异性的转基因载体。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张献伟，吴珍芳，李紫聪，刘德武，
申请(专利权)人：吴珍芳，李紫聪，
类型：发明
国别省市：