转基因家蚕打靶载体的构建方法技术

本发明专利技术公开了转基因家蚕打靶载体的构建方法，该方法的步骤包括根据家蚕丝素轻链基因序列，设计０．５ｋｂ和５ｋｂ基因片段ＰＣＲ扩增的专用引物；将丝素轻链基因０．５ｋｂ和５ｋｂ基因片段以ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行ＰＣＲ扩增；然后将０．５ｋｂ与ｐＢｌｕｅｓｅｌｅｃｔ质粒经ＸｈｏＩ和ＡｐａＩ双酶切后以Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接成ｐＢｓ－ＦＳ中间质粒；５ｋｂ与ｐＢｓ－ＦＳ经ＢａｍＨＩ和ＸｂａＩ双酶切后以Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接成ｐＢｓ－ＦＳ－ＦＬ中间质粒；构建带有目的基因ＧＦＰ的质粒ｐＵＣＧＦＰ；再将ｐＢｓ－ＦＳ－ＦＬ与ｐＵＣＧＦＰ经ＰｓｔＩ和ＢａｍＩ双酶切后以Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接构建成转基因蚕丝腺生物反应器基因打靶载体ｐＢｓ－ＦＳ－ＧＦＰ－ＦＬ。本发明专利技术方法简便、廉价并具有较高的目的基因导入率。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物
转基因载体的构建方法，特别是家蚕打靶载体的构建方法。
技术介绍
自1983年Smith等建立杆状病毒表达系统以来，已有500多种外源基因在这一系统中得到了表达，这也使得用家蚕作为生物反应器生产药用蛋白成为可能，前田进等(1985)利用这一系统成功地在家蚕中表达了人体干扰素。用家蚕作为生物反应器生产药用蛋白，具有生产成本低，放大生产容易等优点。但由于重组病毒不能口服感染家蚕，并引起宿主死亡，使得每批生产时都要接种病毒，操作繁琐，也引起每批蚕的表达水平难以控制；另外，从家蚕或其血淋巴中纯化目的蛋白也较为困难。这些因素制约着家蚕生物反应器的商业化生产。各种转基因技术和手段的日渐成熟，使得转基因动物相继问世，也为转基因家蚕的获得提供了基础。Yagaguchi等(1989)测定了家蚕丝素轻链基因序列(基因库登录号X17291)。家蚕丝腺在5龄期可合成大量丝蛋白，约0.5克，因此家蚕丝素蛋白启动子是家蚕中最强的启动子，若能使外源目的基因通过同源重组整合到家蚕基因组中，在丝素蛋白启动子的控制下得到表达，则可用于药用蛋白的大量生产；同时家蚕繁殖快，饲养容易，一旦获得所需的转基因家蚕，可迅速放大生产；蚕丝的成分简单，分离目的蛋白容易，生产成本将会大大降低；家蚕的转基因技术也可用于改良蚕丝性状，使家蚕的育种迈上一个新的台阶。因此利用转基因技术进行家蚕丝腺生物反应器的研究具有重要的理论价值和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简便、廉价的。本专利技术的，包括以下步骤1)设计引物a)根据家蚕丝素轻链基因序列，设计0.5kb和5kb基因片段PCR扩增的专用引物 b)为便于连接和克隆，5kb基因片段PCR扩增两段专用引物设计时分别引入XbaI和BamHI酶切位点；0.5kb基因片段专用引物设计时分别引入ApaI和XhoI酶切位点；2)丝素轻链基因0.5kb和5kb基因片段以Taq DNA聚合酶进行PCR扩增；3)0.5kb与pBlueselect质粒经Xho I和Apa I双酶切后以T4 DNA连接酶连接成pBs-FS中间质粒；4)5kb与pBs-FS经BamHI和XbaI双酶切后以T4 DNA连接酶连接成pBs-FS-FL中间质粒；5)带有目的基因GFP的质粒pUCGFP构建；6)pBs-FS-FL与pUCGFP经PstI和BamI双酶切后以T4 DNA连接酶连接构建成转基因蚕丝腺生物反应器基因打靶载体pBs-FS-GFP-FL。本专利技术中，限制性内切酶、T4 DNA连接酶和Taq DNA聚合酶购自上海博亚生物技术有限公司；PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成；PCR产物纯化试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自上海生工生物技术有限公司。本专利技术的优奌在于方法简便，成本低并具有较高的目的基因导入率。附图说明图1是转基因家蚕打靶载体的构建流程图。具体实施例方式具体实施方法按构建流程图分步骤进一步叙述。1、0.5kb和5kb丝素轻链基因片段PCR扩增引物设计根据Yagaguchi等测定的家蚕丝素轻链基因序列(基因库登录号X17291)，设计0.5kb和5kb基因片段PCR扩增的专用引物为 为便于连接和克隆，5kb基因片段PCR扩增两段专用引物设计时分别引入XbaI和BamHI酶切位点；0.5kb基因片段专用引物设计时分别引入ApaI和XhoI酶切位点。2、0.5kb和5kb丝素轻链基因片段PCR扩增5kb丝素轻链基因片段按下列条件分别进行PCR扩增10×PCR缓冲液 2.5μldNTP(2.5mmol/L) 1μl家蚕丝腺基因组模板(0.025μg/μl) 1μl引物-1(5μmol/L) 1μl引物-2(5μmol/L) 1μlTaq DNA聚合酶(5U/μl) 0.2μl无菌水18.3μl总体积25μl其中10×PCR缓冲液20mM MgSO4，100mM KCl，80mM(NH4)2SO4，100mMTris-Cl，pH9.0，0.5％NP-40，以上混合物以94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，35个循环，72℃再延伸10分钟进行PCR扩增得到5kb丝素轻链基因片段。按同样条件以引物-3和引物-4进行PCR扩增得到0.5kb丝素轻链基因片段。基因片段以PCR产物纯化试剂盒(上海生工)按操作说明书进行纯化，用紫外分光光度计测定其OD260。3、0.5kb与pBlueselect质粒经Xho I和Apa I双酶切后连接成pBs-FS中间质粒1)PCR获得的0.5kb片段以Xho I和Apa I双酶切形成粘性末端，反应条件如下0.5kb PCR纯化产物 10μlBuffer B+ 3μlApaI 2μlddWater 20μl总体积35μl37℃反应2小时；酚氯仿抽提回收后溶于20μl水中。0.5kb产物(ApaI酶切产物) 20μlBuffer H 3μlXhoI 2μlddWater 10μl总体积35μl37℃反应2小时；80℃10分钟灭活内切酶。2)pBlueselect质粒经Xho I和Apa I双酶切后形成粘性末端，反应条件如下PBlueselect(pBs) 5μlBuffer B+ 5μlApaI 2μlddWater 23μl总体积35μl37℃反应2小时；酚氯仿抽提回收后溶于20μl水中。PBs(ApaI酶切产物) 20μlBuffer H 3μlXhoI 2μlDdWater 10μl总体积35μl37℃反应2小时；80℃10分钟灭活内切酶。3)0.5kb与pBlueselect质粒经T4 DNA连接酶连接成pBs-FS中间质粒，反应条件如下0.5kb DNA/ ApaI+XhoI 5μlpBs/ApaI+XhoI 2μlT4 DNA连接酶 1μlT4连接酶缓冲液1μlddWater 4μl16℃连接16小时以上，保存于-20℃备用。4、5kb与pBs-FS经BamHI和XbaI双酶切后连接成pBs-FS-FL中间质粒1)经PCR获得的5kb片段以BamHI和XbaI双酶切形成粘性末端，反应条件如下5kb PCR纯化产物 10μlBuffer G 3μlBamHI 2μlddWater 20μl总体积35μl37℃反应2小时；酚氯仿抽提回收后溶于20μl水中。5kb产物(BamHI酶切产物)20μlBuffer M 3μlXbaI 2μlddWater 10μl总体积35μl37℃反应2小时；80℃10分钟灭活内切酶。2)pBs-FS中间质粒经BamHI和XbaI双酶切后形成粘性末端，反应条件如下pBs-FS中间质粒5μlBuffer G 5μlBamHI 2μlddWater 23μl总体积35μl37℃反应2小时；酚氯仿抽提回收后溶于20μl水中。PBs-FS(BamHI酶切产物) 20μlBuffer M 3μlXbaI 2μlddWater 10μl总体积35μl37℃反应2小时；80℃ 10分钟灭活内切酶。3)5kb与PBs-FS质粒经T4 DNA连接酶连接成pBs-FS-FL中间质粒，反应条件如下5kb DNA/ BamHI+Xba本文档来自技高网...

【技术保护点】
转基因家蚕打靶载体的构建方法，包括以下步骤：１）设计引物ａ）根据家蚕丝素轻链基因序列，设计０．５ｋｂ和５ｋｂ基因片段ＰＣＲ扩增的专用引物：＊＊＊ｂ）５ｋｂ基因片段ＰＣＲ扩增两段专用引物设计时分别引入ＸｂａＩ和ＢａｍＨＩ酶切位 点，０．５ｋｂ基因片段专用引物设计时分别引入ＡｐａＩ和ＸｈｏＩ酶切位点；２）丝素轻链基因０．５ｋｂ和５ｋｂ基因片段以Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶进行ＰＣＲ扩增；３）０．５ｋｂ与ｐＢｌｕｅｓｅｌｅｃｔ质粒经Ｘｈｏ Ｉ和Ａｐａ Ｉ双酶切后以Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接成ｐＢｓ－ＦＳ中间质粒；４）５ｋｂ与ｐＢｓ－ＦＳ经ＢａｍＨＩ和ＸｂａＩ双酶切后以Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接成ｐＢｓ－ＦＳ－ＦＬ中间质粒；５）带有目的基因ＧＦＰ的质粒ｐＵＣＧＦＰ构建；６）ｐＢｓ－ＦＳ－ＦＬ与ｐＵＣＧ ＦＰ经ＰｓｔＩ和ＢａｍＩ双酶切后以Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接构建成转基因蚕丝腺生物反应器基因打靶载体ｐＢｓ－ＦＳ－ＧＦＰ－ＦＬ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：缪云根，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]