K14-VEGF转基因小鼠模型及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于动物模型技术领域。本发明专利技术提供了一种K14-VEGF转基因小鼠模型及其构建方法，是利用原核显微注射技术将包含人类角蛋白14启动子和鼠编码基因VEGF-A164插入到FVB鼠基因组内，由人类角蛋白14启动子控制的小鼠VEGF-A164表达，使转基因鼠表皮基底层过度表达VEGF-A164。本发明专利技术构建的K14-VEGF转基因动物模型可自发的产生银屑病表型特征。本发明专利技术的K14-VEGF转基因小鼠模型进一步地筛选、纯化与建系。本发明专利技术的动物模型可应用于研究银屑病发病机理和筛选预防和治疗银屑病的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物模型
，具体涉及一种K14-VEGF转基因小鼠模型及其构建方法，以及在银屑病发病机理研究和筛选预防治疗银屑病药物中的应用。
技术介绍
银屑病动物模型的探索与构建大概经历了以下三个阶段。第一阶段，自发动物模型阶段。早期由于对疾病病因、发病机制的了解不多，加之实验条件的限制，人类很难构建皮肤病的动物模型，但是自然界中有一些动物自发地出现疾病某些病理特征，人们则利用这些有限的资源做科学研究。第二阶段，人工构建动物模型阶段。随着科学的进步，医学基础学科、医学相关学科也得到相应的发展，尤其是免疫学和分子生物学的迅速发展对皮肤病动物模型的建立起到了巨大的推动作用。此时人们可以根据已有的知识和实验手段构建粗糙乃至精确的动物模型。20世纪80年代以前，人们主要通过外用、皮下注射某些药物成分来构建一些比较粗糙的模型。自20世纪80年代起，由于免疫学的发展，将患者皮片移植到免疫缺陷鼠的模型成为研究部分皮肤疾病的有力工具。第三阶段，在分子生物学发展的背景下，转基因动物技术越来越完善成熟。转基因动物几乎涉及到皮肤病动物模型的各个领域。人们甚至可以精确地研究某个因子在疾病发生过程中的作用。银屑病是皮肤科常见病，银屑病的动物模型也是研究的重点。转基因动物是指基因组中整合有外源基因的动物。人们可以运用转基因技术将外源基因导入体细胞，从而培育出新的动物品系或用于专门研究的动物模型。1990年，Rothnagel率先提出可通过转基因方法使特异性基因在动物体内表达，而为人类有遗传倾向的皮肤疾病提供有价值的动物模型。例如，某些细胞因子和生长因子可通过转因手段在动物体内过度表达，从而产生银屑病样反应(参见文献Targeting GeneExpression to the Epidermis of Transgenic Mice:Potential Applications toGenetic Skin Disorders. Journal of InvestigativeDermatology(1990)95,59S -61S;do1:10. 1111/1523 -1747.印12505805)血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)是由角蛋白细胞分泌的一种血管内皮细胞特异性有丝分裂原。在多种组织中，促进血管增生；在银屑病皮损中过度表达加速血管增生，增加内皮细胞上血管的渗透性，引起炎症细胞的迁移，刺激粘附分子-1 (ICAM-1)及内皮细胞粘附分子-1 (VCAM-1)的表达(参见文献Yu-Ping Xia, Baosheng Li, Donna Hylton, etc. Transgenicdelivery of VEGFto mouse skin lead to an inflammatory condition resemblinghuman psoriasis.Blood2003;102(1):161-168.)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种K14-VEGF转基因小鼠模型，本专利技术的另一目的是提供该转基因小鼠模型的构建方法，以及在银屑病发病机理研究和筛选预防治疗银屑病药物中的应用。本专利技术的技术方案是，利用原核显微注射技术将包含人类角蛋白14 (K14)启动子和鼠编码基因VEGF-A164插入到FVB鼠基因组内，由人类角蛋白14 (K14)启动子控制的小鼠VEGF-A164表达，使转基因鼠表皮基底层过度表达VEGF-A164。本专利技术的第一方面，提供了一种K14-VEGF转基因小鼠模型的构建方法,该构建方法包括以下步骤A、PCR 扩增 attBl-mVEGF164-attB2 (如 SEQ ID NO:1 所示)和 attB2r_hGH_attB3(如 SEQ ID N0:2 所不)，BP (BP recombination)反应构建中间载体 pDown_mVEGF164 和pTail-hGH ；B、利用 Gateway Technology (Gateway 克隆技术)将 pUp_K14、pDown-mVEGF164>pTail-hGH 与常规质粒 pRP. Des3d 进行 LR 反应(LR recombination),构建 pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH ；C、阳性克隆测序确认后，线性化后回收相应片段，对受精卵雄原核进行显微注射，制备转基因小鼠并逐步进行繁殖纯化。所述的一种K14-VEGF转基因小鼠模型的构建方法，具体步骤如下I ) K14-VEGF164转基因片段的构建i ) pRP. EX3d-K14>mVEGF164>hGH 载体的构建ii ) PCR 扩增 attBl-mVEGFlM-attB2 和 attB2r_hGH_attB3设计并合成引物如下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种K14?VEGF转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，该方法是利用原核显微注射技术将包含人类角蛋白14启动子和鼠编码基因VEGF?A164插入到FVB鼠基因组内，由人类角蛋白14启动子控制的小鼠VEGF?A164表达，使转基因鼠表皮基底层过度表达VEGF?A164。

【技术特征摘要】
1.一种K14-VEGF转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，该方法是利用原核显微注射技术将包含人类角蛋白14启动子和鼠编码基因VEGF-A164插入到FVB鼠基因组内， 由人类角蛋白14启动子控制的小鼠VEGF-A164表达，使转基因鼠表皮基底层过度表达 VEGF-AI64ο2.根据权利要求1所述的一种K14-VEGF转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤A、PCR扩增如 SEQ ID NO:1 所示的 attBl-mVEGF164-attB2 和如 SEQ IDN0:2 所示所示的 attB2r-hGH-attB3，BP 反应构建中间载体 pDown_mVEGF164 和 pTail-hGH ；B、利用Gateway 克隆技术将 pUp_K14、pDown_mVEGF164、pTail-hGH 与常规质粒 pRP. Des3d 进行 LR 反应，构建 pRP. EX3d-K14>mVEGF164&g...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡晋红，李红，孙军，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：