【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗体的制备
，具体涉及一种。
技术介绍
单抗药物发展经历了鼠源性单抗，嵌合性单抗、人源化单抗和全人源化单抗四个阶段。1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，形成杂交瘤(hybridoma)细胞，这种细胞继承两种亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有合成和分泌抗体的能力。用这种来源于单个融合细胞增殖的细胞群，可制备针对一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。经过杂交瘤技术得到的鼠源性抗体，用于人体治疗时存在一些问题。首先，由于鼠源性单抗对于人体是异种蛋白，因此，应用于人体后，很容易引发针对异种蛋白的免疫反应，影响单抗的治疗效果。其次，鼠单抗通常不能有效地激活人体的生物效应功能，如补体依赖的细胞毒(CDCC)及抗体依赖的细胞毒(ADCC)作用。此外，鼠单抗在人体内的半寿期也比较短。这些都限制了鼠源性单抗的治疗作用。人源化的抗体可以解决这些问题，通过用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中而构建的嵌合抗体，其人源化程度达...
【技术保护点】
一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法，包括以下步骤：（1）传染病病原体抗原的制备：以常规方法在真核或原核细胞中生产并纯化重组传染病病原体抗原蛋白；（2）抗体的标记：将上步纯化的重组传染病病原体抗原蛋白以荧光或生物素标记；（3）B细胞的获取、富集与纯化：从传染病患者或疫苗免疫者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化；（4）标记抗原与特异性B细胞的结合：将步骤（2）中标记的重组传染病病原体抗原蛋白与步骤（3）中的B细胞进行特异性结合；（5）抗原特异性B细胞的获取：根据标记，以流式细胞仪筛选、分离出上步中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞；（6）扩增抗体可变区基因...
【技术特征摘要】
1.一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法，包括以下步骤 (1)传染病病原体抗原的制备以常规方法在真核或原核细胞中生产并纯化重组传染病病原体抗原蛋白； (2)抗体的标记将上步纯化的重组传染病病原体抗原蛋白以荧光或生物素标记； (3)B细胞的获取、富集与纯化从传染病患者或疫苗免疫者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化； (4)标记抗原与特异性B细胞的结合将步骤(2)中标记的重组传染病病原体抗原蛋白与步骤(3)中的B细胞进行特异性结合； (5)抗原特异性B细胞的获取根据标记，以流式细胞仪筛选、分离出上步中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞； (6)扩增抗体可变区基因采用核苷酸序列如SEQID NO:1 SEQ ID N0:58所示系列特异性的混合引物，应用单细胞巢式RT-PCR从所述单个标记的B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因； (7)构建表达载体将上步所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，成功连接后转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA ； (8)重组抗体表达与纯化以上步纯化后的表达载体DNA转染真核细胞，培养使其获得表达后经分离纯化得重组抗体。2.一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法，包括以下步骤 (1)外周血B细胞的富集与纯化从传染病患者或疫苗免疫者外周血分离单核细胞，采用密度梯度离心纯化； (2)B细胞分离由流式细胞仪直接分离单个B细胞； (3)B细胞特异性鉴定对流式细胞仪单个B细胞的上清液首先进行功能性的鉴定，筛选出具备特异性的单个B细胞； (4)扩增抗体可变区基因采用一系列特异性的混合引物，应用单细胞巢式RT-PCR从上述具备特异性的单个B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因； (5)构建表达载体将上步所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，成功连接后转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA ； (6)重组抗体表达与纯化以上步纯化后的表达载体DNA转染真核细胞，培养使其获得表达后经分离纯化得重组抗体。3.根据权利要求1或2所述的传染病病原体全人源化抗体的制备方法，其特征在于，在权利要求1所述步骤(3)或权利要求2所述步骤(I...
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